Спосіб визначення концентрації білірубіну в жовчі

Спосіб визначення концентрації білірубіну в жовчі, що включає спектрофотометричні виміри, який відрізняється тим, що пробу міхурової або дуоденальної жовчі центрифугують, розбавляють 0,9% розчином хлориду натрію, реєструють спектр поглинання в області 350-600 нм, за відсутності максимумів поглинання при 530-540 та 570-580 нм визначають оптичну густину розчину при 414 нм і розраховують вміст білірубіну в міхуровій жовчі за формулою (1), а в дуоденальній жовчі - за формулою (2) Винахід належить до лабораторних методів дослідження і може бути використаним для визначення вмісту білірубіну в жовчі Відомий спосіб визначення концентрації білірубіну в жовчі [1] базується на здатності білірубіну утворювати в реакції азосполучення з діазореактивом забарвлену сполуку, інтенсивність поглинання якої при 540 нм залежить від КІЛЬКОСТІ компонента, що визначається Недоліком вказаного способу є необхідність використання великого набору реагентів, а також підготовка калібрувального графіка за стандартним білірубіном Найбільш близьким за технічною сутністю та досягнутим ефектом є спосіб, що містить спектрофотометричні виміри концентрації білірубіну в жовчі при дуоденальному зондуванні [2] Згідно способу визначення зміни концентрації білірубіну проводять шляхом графічної реєстрації спектрофотометричних вимірів безперервно в потоці жовчі при її виділенні через зонд дота після стимуляції рухової активності жовчного міхура Виміри проводять при 440-460 і 520-540 нм, що відповідає максимуму та мінімуму в спектрі поглинання стандартного білірубіну Зміну концентрації білірубіну визначають за формулою з урахуванням параметрів поглинання Головним недоліком способу є той факт, що виміри оптичної густини жовчі при дуоденальному зондуванні проводять в діапазоні, який відповідає максимуму поглинання стандартного білірубіну в органічному розчиннику, але не є аналітичним значенням для жовчі, тому що не збігається з положенням основної смуги поглинання, зумовленою суперпозицією різних похідних білірубіну при їх асоціації з компонентами макромолекулярного комплексу жовчі Крім того, спосіб не враховує варіант можливої наявності похідних гемоглобіну при виливу крові в жовч, що призводить до суттєвих змін спектральних параметрів жовчі, тому що порфіриновий хромофор гема має характерне поглинання в ужитому спектральному діапазоні Тому невідповідність уживаного аналітичного діапазону довжин хвиль справжньому положенню максимуму поглинання жовчі, а також відсутність контролю наявності похідних гемоглобіну, може в кінцевому підсумку призвести до недостовірних результатів діагностики Вказаний спосіб обмежений аналізом жовчі при дуоденальному зондуванні і не призначений для діагностичного дослідження міхурової жовчі, отриманої під час оперування хворих жовчнокам'яною хворобою ю С = 937,5 + 15,4 D-V D-V С = 73,2 + 25,2 • L (2) де С - концентрація білірубіну в жовчі, мкмоль/л, D - оптична густина при 414 нм, V - величина розбавлення жовчі 0,9% розчином хлориду натрію, L - товщина оптичного шару, см со 43721 В основу винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб, в якому нові умови спектрофотометричних вимірів дозволили б збільшити точність визначення концентрації білірубіну в міхуровій та дуоденальній жовчі Поставлена задача розв'язується наступним чином Пробу міхурової або дуоденальної жовчі центрифугують, розбавляють 0,9% розчином хлориду натрію, вимірюють спектр поглинання в області 350-600 нм, визначають оптичну густину розчину при 414 нм за відсутності максимумів поглинання при 530-540 і 570-580 нм і розраховують вміст білірубіну в міхуровій жовчі по формулі (1), а в дуоденальній жовчі - по формулі (2) С = 937,5 + 15,4 D-V D-V С = 73,2 + 25,2 • L (1) (2) де С - концентрація білірубіну в жовчі, мкмоль/л, D - оптична густина при 414 нм, V - величина розбавлення жовчі 0,9% розчином хлориду натрію, L - товщина оптичного шару, см Загальними ознаками прототипу та способу, який заявляється, є наступні - визначення концентрації білірубіну на основі прямих спектрофотометричних вимірів жовчі, - проведення вимірів параметрів поглинання жовчі у видимім діапазоні ВІДМІННИМИ ознаками є - визначення оптичної густини при аналггичній довжині хвилі 414 нм, - встановлення відсутності максимумів поглинання при 530-540 і 570-580 нм, - визначення концентрації білірубіну в міхуровій жовчі Поєднання загальних і ВІДМІННИХ ознак дозволяє вирішити поставлене завдання Відсутність поєднання відомих і ВІДМІННИХ ознак в попередній техніці дозволяє вважати, що спосіб, який заявляється, відповідає умові патентоздатності "новизна" Спосіб, який заявляється, явно не виходить з рівня техніки, отже він відповідає критерію "винахідницький рівень" Спосіб, який заявляється, може бути використаний в КЛІНІЧНІЙ діагностиці Приклад 1. Міхурову жовч, взяту під час оперування хворих на жовчнокам'яну хворобу, і жовч, взяту при дуоденальному зондування (порції А, В, С) центрифугують і при необхідності розбавляють 0,9% розчином хлориду натрію Вимірюють спектр поглинання жовчі в області 350-600 нм на спектрофотометрі Спекорд М40, підбирають кювету з товщиною оптичного шару, ВІДПОВІДНОЮ ДО величини екстинкції препарату При дослідженні 40 зразків жовчі встановлено, що довжина хвилі основного максимуму поглинання у виміряній області становить 414 + 0,95 нм Тому виміри оптичної густини проводять при вказаному значенні аналітичної довжини хвилі У ряді випадків при наявності крові в міхуровій жовчі в спектрах поглинання додатково спостерігаються дві мінорні смуги при 530-540 та 570-580 нм, що свідчить про наявність похідних гемоглобіну, основна смуга поглинання котрих (біля 414 нм) співпадає з областю поглинання білірубіну в зразку жовчі Вказані зразки вилучаються при проведенні КІЛЬКІСНОГО визначення білірубіну через неможливість урахування додаткового відносного внеску похідних гемоглобіну в сумарне поглинання препарату Отримані значення оптичної густини жовчі при 414 нм використовують для розрахунку коефіцієнта екстинкції К з урахуванням розбавлення і товщини шару поглинання за формулою (3) К = D-V L (3) де К - коефіцієнт екстинкції, D - оптична густина при 414 нм, V - величина розбавлення жовчі 0,9% розчином хлориду натрію, L - товщина оптичного шару, см Рівнобіжно проводять визначення білірубіну відомим методом [1] з використанням колірреагенту, що містить діазореактив Результати визначення коефіцієнта екстинкції при 414 нм і вмісту білірубіну в міхуровій та дуоденальній жовчі відомим методом наведено в таблицях 1, 2 Із використанням регресійного аналізу досліджена залежність концентрації білірубіну С від коефіцієнта екстинкції К окремо для міхурової (табл 1) і дуоденальної (табл 2) жовчі, які суттєво різняться за вмістом компонента, що визначається Встановлено, що досліджу вальна залежність має ЛІНІЙНИЙ характер (формула (4) для міхурової жовчі і формула (5) - для дуоденальної) С = 937,5+ 15,4- К С = 73,2+ 25,2-К (4) (5) Значення коефіцієнта кореляції між концентрацією білірубіну, знайденою за відомим методом, і величиною коефіцієнта екстинкції жовчі дорівнює 0,84 (Р < 0,1%) для міхурової і 0,91 (Р < 0,1%) для дуоденальної жовчі, що дозволяє визначити вміст білірубіну за величиною оптичної густини при 414 нм (D) із урахуванням и розбавлення (V) і товщини оптичного шару (L) для міхурової жовчі за формулою (1) і для дуоденальної - за формулою (2) Приклад 2. Визначають вміст білірубіну в міхуровій жовчі, взятій при операції хворої на жовчнокам'яну хворобу (хвора С , 53 роки, історія хвороби № 824) У спектрі поглинання проби жовчі, розбавленої в 50 разів, в області 350-600 нм спостерігається максимум поглинання при 414 нм, а максимуми поглинання в областях 530-540 та 570-580 нм відсутні Величина оптичної густини при 414 нм у 0,2 см кюветі дорівнює 1,56 Вміст білірубіну в міхуровій жовчі розраховують за формулою (1) С = 957,4+ 15,5 1,56 • 50 = 7002 мкмоль/л 0,2 43721 В результаті розв'язання поставленої задачі досягнуто збільшення точності експрес-визначення вмісту білірубіну як у міхуровій, так і в дуоденальній жовчі шляхом безпосереднього виміру и оптичних параметрів без використання спеціальних реагентів Джерела інформації, взяті до уваги при експертизі 1 Ганиткевич Я В , Корбач Я И Исследование желчи Биохимические и биофизические методы - К Вища шк Головное изд-во -1985 - С 45-49 2 Авторское свидетельство СССР, кл G 01 N33/48, 1982 Таблиця 1 Значення коефіцієнта екстинкції при 414 нм і концентрації білірубіну препаратів міхурової жовчі Зразок Коефіцієнт екстинкції при 414 нм Концентрація білірубіну, мкмоль/л 1 77,3 2206,0 2 243,5 6869,0 3 164,6 4104,0 4 189,0 4104,0 5 366,0 5694,0 6 92,2 1436,5 7 280,0 6002,1 8 119,3 1513,5 9 114,6 1513,5 10 285,0 5130,0 11 115,6 3950,3 12 106,2 3039,8 13 317,8 6284,3 14 347,5 5258,3 15 223,6 3642,3 16 226,7 4693,9 Таблиця 2 Значення коефіцієнта екстинкції при 414 нм і концентрації білірубіну препаратів дуоденальної жовчі Зразок Коефіцієнт екстинкції при 414 нм Концентрація білірубіну, мкмоль/л Порція А 1 2,4 179,6 2 6,9 124,5 3 0,4 61,6 4 2,9 153,9 5 4,2 153,9 6 6,6 212,9 7 14,6 682,3 8 4,0 123,2 Порція В 9 50,3 1138,8 10 34,0 908,2 11 18,0 287,3 12 26,3 608,0 13 27,2 1138,8 14 25,3 1051,7 15 10,9 212,9 43721 Продовження табл 2 Зразок Коефіцієнт екстинкції при 414 нм Порція С Концентрація білірубіну, мкмоль/л 16 8,2 246,3 17 5,5 246,3 18 14,0 364,2 19 0,6 92,3 20 3,4 153,9 21 4,5 229,6 22 9,1 302,7 23 7,4 212,9 24 0,9 123,2 Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122) 3-72-89 (03122) 2-57-03