Спосіб виробництва альбуміну бичачого сироваткового (бса)

Спосіб виробництва альбуміну бичачого сироваткового (БСА), що включає виділення альбумінової фракції із сироватки крові великої рогатої худоби, який відрізняється тим, що виділення проводять методом хроматографії з використанням макропористих, кремнеземвмісних сорбентів марки "СХ-50", з подальшою регенерацією сорбентів розчином Комаровського та зрівноваженням хроматографічної колонки за допомогою 0,05 М калій-фосфатного буферного розчину з рН-7,2 Винахід відноситься до медичної, ветеринарної, мікробіологічної, вірусологічної та бютехнолопчної промисловостей і може бути використаний для виробництва напівсинтетичних живильних середовищ при культивуванні мікроорганізмів, зокрема, лептоспір, у лабораторних умовах, для виготовлення профілактичних та діагностичних препаратів Відомий спосіб адсорбційної хроматографії білків на макропористих кремнеземах Його використовують для виділення бюполімерів із складних сумішей Цей спосіб дозволяє одержати біополі мер у чистому вигляді і сконцентрувати його Для виділення альбуміну використовують силікагелі типу Spherosit марок ХОА, ХОВ та ХОС Проте виділений таким чином альбумін не використовується як препарат, який включають до складу середовищ для культивування лептоспір, так як він містить ДОМІШКИ ІНШИХ біЛКІВ [1] Відомий спосіб одержання альбуміну із сироватки крові овець для культивування лептоспір висолюванням сірчанокислим амонієм Кров збирають на м'ясокомбінатах при забої овець, дефібринують і сепарують и До сироватки додають 1 1 насичений розчин сірчанокислого амонію Осаджені глобуліни видаляють фільтруванням через бельтінгтканину або центрифугуванням Потім сироватку підкислюють соляною кислотою до рН 4,6-4,8 і додають до повного насичення порошок сірчанокислого амонію Білково-сольовий осад концентрують пресуванням і очищають від солей діалізом в проточній воді Розчин альбуміну очищають центрифугуванням і послідуючою фільтрацією спочатку через пластини марки "Ф", а потім "СФ" Стериль ний альбумін фасують у флакони і зберігають при температурі 2°С (прототип) [2] Недоліком способу є те, що в деяких серіях альбуміну міститься до 20 % високо ненасичених токсичних для лептоспір жирних кислот Таким способом отримують препарат з вмістом 65-82 % чистого альбуміну Крім альбуміну в альбуміновій фракції, виділений таким чином, міститься 10-16 видів інших білків Також містяться в деяких серіях 25 % баластних високомолекулярних білків, що може призводити до неможливості стерилізуючої фільтрації, недостатнього нагромадження біомаси або відсутності росту культур та збільшення реактогенності вакцин, що виготовляють на середовищах з використанням такого альбуміну [3] В основу винаходу поставлена задача розробити технологічний спосіб одержання чистого альбуміну бичачого сироваткового, який можна використовувати для культивування лептоспір з метою підтримки штамів, виготовлення вакцин проти лептоспірозу і діагностикумів Для досягнення задачі винаходу використали спосіб, що включає виділення альбумінової фракції із сироватки крові великої рогатої худоби, згідно винаходу, виділення проводять методом хроматографії з використанням макропористих кремнеземвмісних сорбентів марки "СХ-50", з подальшою регенерацією сорбентів розчином Комаровського та зрівноваженням хроматографічної колонки за допомогою 0,05 М калій-фосфатного буферного розчину з рН-7,2 Спосіб здійснюють наступним чином проводять регенерацію сорбентів марки "СХ-50" розчином Комаровського На водяній бані кремнезем із розчином Комаровського доводять до кипіння і кип'ятять на малому вогні 1 год Підготовленим та (О со 42436 ким чином, кремнеземом наповнюють хроматографічну колонку рівномірно і щільно, проводять зрівноваження колонки за допомогою 0,05 М калійфосфатного буферного розчину з рН-7,2, в колонку заливають сироватку крові великої рогатої худоби (рН 7,2), об'єм якої становить 1/5 об'єму колонки Об'єм колонки розраховують за формулою VKC^I-SXH , де S- це площа колонки, яка визначається за формулою S=7ir2/4, дє ті-3,14, r-радіус колонки, а Н- висота колонки Збирають фракції при довжині хвилі Я.-280 нм, та значенні показника оптичної густини (ОГ) 0,05 Об'єднують отримані фракції в одну, заміряють ОГ і визначають імунологічну чистоту методом електрофорезу у поліакріамідному гелі (ПААГ) При хроматографічному розділенні сироватки крові глобуліни першими осідають на кремнезем, а альбумін - інертний білок, безперешкодно виходить із колонки Крім імуноглобулінів на колонці сорбуються токсичні елементи Усунення фактора токсичності є дуже важливим при культивуванні лептоспір Методом електрофорезу встановили, що альбумін, одержаний методом висолювання сірчанокислим амонієм, містить ще фракцію глобулінів, а альбумін, одержаний методом хроматографії, є чистим препаратом (див фіг 1) Порівняльні результати використання альбумінів, що досліджувались в поживних середовищах для культивування лептоспір представлені у таблиці Наведені дані середнього нагромадження лептоспір у середовищі EMJH з альбуміном, виготовленим методом висолювання сірчанокислим амонієм та альбуміном, виготовленим методом хроматографії з використанням макропористих кремнеземвмісних сорбентів марки "СХ-50" З даних таблиці, середнє нагромадження біомаси лептоспір при використанні альбуміну виготовленого методом хроматографії становить 430±2,4, що в 1,6 разів більше, ніж при використанні альбуміну, виготовленого методом висолювання сірчанокислим амонієм - 275±2,8 Альбумін, виділений методом хроматографії з використанням макропористих кремнеземів, є чистим препаратом, не містить домішок інших білків, придатний для виготовлення живильних середовищ для культивування лептоспір і на їх основі виготовлення якісних вакцин і діагностикумів Альбумін, виготовлений цим методом, є дешевим (за рахунок використання сироватки крові великої рогатої худоби, яка на м'ясокомбінатах є відходом виробництва), виготовлення його є технологічним процесом На графічних матеріалах зображена електрофореграма альбуміну, одержаного двома способами На фіг 1 (позиція 1) зображено фракцію альбуміну, виготовленого методом хроматографії з використанням макропористих кремнезевмісних сорбентів марки "СХ-50" На фіг 2 зображено, що альбумін, виготовлений методом висолювання сірчанокислим амонієм, містить фракцію альбуміну (позиція 2) та фракцію глобулінів (позиція 3) Джерела інформації 1 Коликов В М, Мгедлишвили Б В Хроматография биополимеров на макропористых кремнеземах -Ленінград, Наука, 1986 г 2 Малахів Ю А Лептоспироз животных - Москва -1992 г 3 И А Артюшина, А С Фоменко, Г И Ежов, С К Артюшин Изучение вариабельности липидного и белкового состава альбуминовой фракции сыроватки // Комплексные гигиенические исследования в практику здравоохранения - Новокузнецк, 1981 -С 439-440 Таблиця Штамп лептоспір Середовище EMJH з альбуміном, виготовленим методом висолювання сірчанокислим амонієм 493 Poland Kabura Perepehcyn Pomona Moskva V Hond Utrecht IV M20 Jes Bratislava 217±3,2 277±2,1 198±3,3 251±1,1 372±3,2 249±2,3 354±3,6 280±3,7 Середовище EMJH з альбуміном, виготовленим методом хроматографії з використанням макропористих кремнеземвмісних сорбентів марки "СХ-50" 421±1,3 456±1,9 339±2,9 445±0,9 435±1,8 427±3,4 462±3,8 451 ±3,2 42436 ФІГ. 1 Фіг. 2 ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Киів-133, бульв Лесі Українки, 26 (044)295-81-42, 295-61-97 Підписано до друку Обсяг обл -вид арк 2002 р Формат 60x84 1/8 Тираж 50 іприм Зам УкрІНТЕІ , 03680, Киів-39 МСП, вул Горького, 180 (044) 268-25-22