Спосіб фотолюмінесцентного імуноаналізу

Спосіб фотолюмінісцентного імуноаналізу, що передбачає іммобілізацію специфічних антитіл або антигенів на тверду фазу приведення її в контакт з розчином досліджуваного антигену або антитіла, одночасну реєстрацію інтенсивності фотолюмінісценцм, який відрізняється тим, що яктверду фазу використовують поруватий фотолюмінофор, реєстрація інтенсивності фотолюмінісценцм здійснюється в стаціонарному режимі і результати аналізу визначаються по ЗМІНІ фізичних властивостей самої підкладинки 1730595 А1 ЗО 04 92 Бюл №16G01 N33/543 Недоліками даного способу є необхідність підтримання спеціального температурного режиму, багатоетапність та велика КІЛЬКІСТЬ необхідних реагентів, що суттєво знижує його ЦІННІСТЬ Існує також метод, згідно якого до досліджуваного зразка додають антитіла, ковалентно іммобілізовані на водорозчинному поліанюні чи полікатіоні, наприклад, поліметакриловій кислоті (ПМАК), та антитіла, кон'юговані з ферментом При цьому в розчині одночасно протікають реакції зв'язування антигену з антитілами, іммобілізованими на ПМАК та з міченими антитілами Після утворення розчинних імунокомплексів розчин приводять у контакт з нерозчинним позитивно зарядженим носієм (полімером) Внаслідок цього компоненти, зв'язані з іммобілізованими антитілами, адсорбуються на носи в результаті іонних взаємодій між молекулами від'ємне зарядженого поліанюна, що містить імунокомплекс антигену з антитілами, міченими ферментом, та позитивно зарядженою матрицею Після промивання носія з метою видалення кон'югату, утвореного антитілами, що неспецифічно зв'язалися з антигеном, на нього наносять розчин субстрату ферменту та КІЛЬКІСНО вимірюють концентрацію продукту, яка пропорційна концентрації антигену, що визначають, та служить характеристикою його вмісту в досліджуваному розчині Концентрацію антигену у досліджуваному зразку визначають за О со 44341 допомогою калібрувального графіка, отриманого кремнію при використанні стандартних препаратів Як доУ порівнянні з прототипом запропонований датково заряджені нерозчинні полімери можуть буспосіб відрізняється тим, що для оцінки результати використані поруваті матриці (нггроцеллюлозні, тів аналізу використовують не фізичні властивості ацетатоцеллюлозні та ІНШІ мембрани), на яких подопоміжної бюактивої речовини, а зміну фізичних передньо був адсорбований полікатюн (напривластивостей самої твердої фази, необхідної і в клад, хітозан, поліетиленимін тощо) Чутливість способі, що пропонується, і в прототипі Зміни фіметоду - 2 5 - 150нг/мл SU 1801214 A3 07 03 93 зичних властивостей самої підкладинки - поруваБюл №9G01 N 33 / 543 того фотолюмінофору, що реєструються в стаціонарному режимі, і визначають результати аналізу Найбільш близьким за технічною сутністю до Це дозволяє скоротити КІЛЬКІСТЬ не лише необхідспособу, що пропонується, є метод конкурентного них реагентів, а й промивань та приведень компоімуно-флуоресцентного визначення антигенів нентів у контакт, що надає можливість використоАналіз здійснюється наступним чином Через провувати метод для експресної діагностики Проветочну флюорометричну кварцову комірку з довжидення аналізу не потребує підтримання спеціальною оптичного шляху 0 005 - 0 1мм послідовно ного температурного режиму та не обтяжене необпропускають розчин специфічних антитіл проти анхідністю застосування додаткових технічних засотигену, що визначається, буферний розчин, розбів (наприклад, системою для прокачування, як в чин, що містить досліджуваний антиген, мічений способі-прототипі) Завдяки цьому ЦІННІСТЬ методу флуоресцентною міткою та вільний антиген, з підвищується швидкістю, не меншою ніж 0 3 мл/мм Вимірюють максимальну величину інтенсивності флуоресценСпосіб здійснюється наступним чином Оптичції, по величині якої за стандартною кривою розрану комірку заповнюють розчином антитіла або анховують невідому концентрацію досліджуваного тигену та поміщають в неї зразок ПК, отриманий антигена в розчині На першій стадії при прокачушляхом ХІМІЧНОГО травлення з використанням пованні розчину антитіл через кювету відбувається їх передньої лазерної обробки поверхні На поверхадсорбційна іммобілізація на внутрішніх стінках коню ПК проводять іммобілізацію антитіл або антигемірки Матеріалом для стінок кювети можуть бути нів, попередньо розчинених в забуференому фізіокварц, полістирол, полівінілтолуол або ІНШІ полімелогічному розчині, протягом 25 - ЗОхв, вимірюючи рні матеріали При прокачуванні через кювету розпаралельно інтенсивність фотолюмінісценцм ПК чину з міченим антигеном та антигеном, що аналіДалі комірку та зразок ПК промивають забуферезується, відбувається сорбція міченого антигену на ним фізіологічним розчином (3 рази по 1хв) та кюстінках комірки, що супроводжується збільшенням вету заповнюють розчином антигену або антитіл сигналу флуоресценції з поверхні комірки ОскільФіксують величину інтенсивності фотолюмінісценки товщина комірки відносно мала (0 005 -0 1 мм), цм (ФЛ) ПК При утворенні імунокомплексів на поа в об'єм проточної комірки безперервно вводятьверхні ПК інтенсивність його ФЛ починає різко змеся нові порції міченого антигена з постійною конценшуватись, по чому можна ідентифікувати наявнтрацією, то сигнал, обумовлений міткою в розчиність ВІДПОВІДНОГО антигена в розчині На фіг 1 поні, буде сталим та відносно малим (інтенсивність казана зміна інтенсивності фотолюмінісценцм з чафлуоресценції пропорційна товщині шару, крізь сом при контакті поруватого кремнію з дистильоваякий проходить збуджуюче світло) 3 ІНШОГО боку, ною водою та розчинами антигену або антитіла взаємодія міченого антигену з антитілами на пове1, та з розчином антиген + антитіло - 2 На фіг 2 рхні стінок комірки обумовлює постійне накопиченпредставлена зміна інтенсивності фотолюмінісценя міченого антигену на стінках комірки, що принцм поруватого кремнію при контакті з дистильозводить до зростання інтенсивності флуоресценції ваною водою - 1 , з розчинами антигену або антитіз часом При цьому, весь процес (інкубація носія з ла - 2, та з розчином антиген + антитіло з часом антитілами, промивка, інкубація з міченим та до(хв) 3 -12,4 - 30,5 - 40,6 - 70,8 -100 сліджуваним антигенами) зводиться до прокачування розчину реагентів крізь проточну комірку Розчин антитіла готувався на основі антиімуфлуорометра, що дозволяє здійснювати процедуноглобуліну G, специфічних моноклональних імуру розділення тих антигенів, які зв'язалися, та тих, ноглобулінів до міоглобіну людини Забуферений які залишилися в розчині, та отримувати інформафізіологічний розчин 20мМ тріс-НСІ, або калій-фоцію про кінцевий результат аналізу без переривансфатний буфер з рН7 5, який містив 0 14М хлорисня процесу Коефіцієнт варіації результатів аналізу того натрію Розчин антигену виготовлявся з імустановить 10-15% RU 2039986 СІ 20 07 95 Бюл ноглобуліну G та міоглобіну людини Спектри ФЛ №20G01 N 33 / 53, 33 / 533 ПК вимірювались при збудженні випромінюванням He-Cd лазера (довжина хвилі Л=0 44мкм) при температурі Т = 290К Блок-схема експериментальної В основу винаходу поставлено задачу розробустановки для вимірювання релаксаційних спектки принципово нового способу імунного аналізу рів представлена на фіг 3, де 1 а - He-Cd або Нешляхом використання фотолюмінісцентних власNe лазер, 1 б - Мг-лазер, 2 - модулятор, 3 - повотивостей поруватих фотолюмінофорів, зокрема ротна призма, 4 - нейтрально сірі (НС) фільтри, 5 поруватого кремнію (ПК) для того, щоб забезпечитримач зразка, 6 - зразок, 7 - сферичне дзеркало, ти більш низькі собівартість та тривалість аналізу 8 - подвійний фото спектрометр - 12 (ПФС - 12), 9 при чутливості аналогічній відомим методам фотоелектропомножувач - 83 (ФЕП - 83), 10 - підМала тривалість аналізу забезпечується менсилювач, 11 - лічильники імпульсів та система вішою, в порівнянні з відомими методами, КІЛЬКІСТЮ дображення На фіг 4 приведений характер релакетапів, а зниження собівартості обумовлене менсації сигналу шою КІЛЬКІСТЮ необхідних реагентів та доступністю 44341 Метод дозволяє скоротити тривалість аналізу чення концентрації біологічно активних речовин, до 1 год і менше Чутливість методу - 1 0 призводить до суттєвого спрощення імунофермен100нг/мл Час аналізу може бути скорочений ще тного аналізу, скорочення часу його проведення та відчутніше (більше ніж в 2 рази), якщо використочисла необхідних операцій Метод може бути завувати пластини ПК з одним з компонентів імунної стосований як у наукових лабораторіях для сповзаємодії, іммобілізованим попередньо стереження за ходом протікання реакції антигенантитіло, так і для створення промислової устаноТаким чином, технічним результатом, якого вки, що дозволить знизити вартість проведення можна досягти при здійсненні винаходу, є те, що одиничного імуноферментного аналізу спосіб, який може бути використаним для визна 44341 ID О 100 200 t mks Фіг. 4 ДП "Український інститут промислової власності "(Укрпатент) Україна, 04119, Киів-119, вул сім'ї Хохлових, 15 (044) 456-20-90