Спосіб одержання гепарину

1 Спосіб одержання гепарину, який включає попередню обробку вихідної гепариновмісної сировини, отримання з неї розчину гепариновмісної складової, виділення гепариновмісної фракції та одержання цільового продукту, який відрізняється тим, що вихідну гепариновмісну сировину попередньо висушують при температурі 60-85 град , подрібнюють, отримують з неї гепариновмісну складову шляхом екстрагування при рН 1-7,6 та температурі 60-85 град впродовж 2 годин, а після виділення з екстракту гепариновмісної фракції одержують цільовий продукт, проводячи його осадження, включення супернатанту в цикл одержання цільового продукту з можливим додатковим очищенням цільового продукту 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як вихідну гепариновмісну сировину використовують сировину рослинного або тваринного походження 3 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що осад гепариновмісної фракції збирають, витримують при підвищеній температурі до відходження рідини, яку видаляють, а оформлений осад використовують для одержання цільового продукту 4 Спосіб за п 3, який відрізняється тим, що оформлений осад збирають, висушують та зберігають до одержання цільового продукту 5 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що одержання цільового продукту включає одноразове розчинення гепариновмісної фракції лугом, осадження етанолом, вилучення та збирання супернатанту, збирання осаду, розчинення-промивання осаду з багаторазовим повторенням циклу, починаючи з осадження етанолом, та наступне висушування цільового продукту 6 Спосіб за п 5, який відрізняється тим, що зібраний супернатант упарюють та включають у цикл одержання цільового продукту 7 Спосіб за п 5, який відрізняється тим, що зібраний супернатант змішують з розчиненою гепарино вмісною фракцією та включають у цикл одержання цільового продукту 8 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що одержання цільового продукту включає його електрофоретичне виділення з гепариновмісної фракції 9 Спосіб за п 5, який відрізняється тим, що одержання цільового продукту включає його додаткове електрофоретичне виділення з гепариновмісної фракції 10 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що додаткове очищення гепарину проводять електрофоретично 11 Спосіб за пп 9, 10, який відрізняється тим, що електрофорез проводять при використанні буферів у межах від фізіологічних значень рН та не вище 8, 6 12 Спосіб за п 11, який відрізняється тим, що як електродний буфер використовують барбітуратний буфер з рН 8,6 за умов наявності в розділяючому середовищі буфера з рН у межах фізіологічних значень та не вище 8,6 13 Спосіб за п 12, який відрізняється тим, що як розділяюче середовище використовують 5% горизонтальний поліакриламідний гель 14 Спосіб за пп 8, 9, який відрізняється тим, що для електрофоретичного виділення гепарину беруть осаджену та висушену гепариновмісну фракцію, яку змішують з буфером 15 Спосіб за пп 8, 9, який відрізняється тим, що електрофорез ведуть в горизонтальному 5% поліакриламідному гелі, який виготовлений з використанням фосфатного буфера, рН якого не вище 7,6, за умов барбітуратного електродного буфера з рН 8,6 16 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що для електрофоретичного виділення беруть осаджену гепариновмісну фракцію, яку розчиняють лугом та доводять рН до - 8,6-12,5 17 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що для електрофоретичного виділення беруть гепариновмісну складову, що одержана при екстрагуванні соляною кислотою, в яку додають луг та доводять рН до 12,5 з внесенням барбітуратного буфера 18 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що для електрофорезу беруть осаджену гепариновмісну фракцію з рН 1 за умов наявності в ній фосфатного буфера з рН 7,6 ю 45127 Винахід відноситься до біологи, медицини, фармації та може бути використаний як для вивчення КІЛЬКІСНОГО вмісту гепарину в біологічних об'єктах, так і для отримання гепарину з гепариновмісних субстратів Гепарин являється кислим глікозаміногліканом (КМПС), який приймає участь у багатьох фізіологічних та патологічних процесах в організмі Найбільш відомою його функцією є вплив на реологічні властивості крові За молекулярною масою гепарин є полідисперсною речовиною Відомий спосіб одержання гепарину /1/, який включає такі технологічні операції - попередню обробку гепариновмісної сировини, якою є сировина тваринного походження, наприклад легені, шляхом їх подрібнення, - отримання розчину гепариновмісної складової сировини, екстрагуючи сировину при нагріванні сольовим розчином з рН 9,5, - виділення з екстракту гепариновмісної фракції, проводячи обробку соляною кислотою, під час чого отримують комплекс гепарин-білок, - одержання цільового продукту, під час чого комплекс гепарин-білок піддають протеолізу з наступними неодноразовими осадженнями спиртом при різних значеннях рН середовища та пропусканням через йонообмінники для вилучення мінералів Однак цей спосіб має такі недоліки 1 Не розповсюджується на лабораторне визначення вмісту гепарину в біологічних субстратах, 2 В лужних умовах при підвищеній температурі може порушуватися структура гепарину, 3 Умови екстрагування гепарину приводять до того, що з сировини екстрагують різний за своєю зрілістю гепарин, 4 Не дозволяє виділяти гепарин з врахуванням його молекулярної маси Відомий спосіб /2/, ВІДПОВІДНО ДО ЯКОГО можна виділити такі технологічні стадії як - Попередня обробка сировини - сироватки крові, в якій наявні глікозамшоглікани, в тому числі і гепарин, розводять водою, - Отримання розчину глікозамшогліканововмісноі складової сировини, додаючи хлорну кислоту, - Виділення з цього розчину глікозамшоглікановмісної фракції у вигляді осаду, додаючи до розчину речовину, що осаджує фосфорновольфрамову кислоту, розчинену у соляній кислоті, з наступним центрифугуванням Осад глікозамшогліканів розчиняють лугом та додають етанол, повторно їх осаджуючи, центрифугуючи та додаючи етанол для повторного їх осадження з подільшим центрифугуванням - Одержання цільового продукту, для чого одержану глікозамшогліканову фракцію розчиняють у воді та виділяють електрофоретичне, використовуючи електрофорез в 9-10% поліакриламідному гелі при рН електродного буферу 7,8-9,0 та силі струму 2 мА на одну трубку Однак цей спосіб має такі недоліки 1 Не дозволяє виділяти з суміші тільки такий глікозамшоглікан як гепарин 2 Не дозволяє проводити виділення гепарину з врахуванням його молекулярної маси 3 Розрахований тільки на лабораторне дослідження сироватки крові Відомий також спосіб (3), у якому попередньо отримують гепариновмісну фракцію з сировини, якою є сировина тваринного походження Для виділення гепарину з суміші кислих глікозамшогліканів використовують комбінацію 2 електрофорезів Перший електрофорез проводять в поліакриламідному гелі в горизонтальних блоках з використанням барбіталового буферу з рН 8,6, як електродного, так і в гелі Після закінчення електрофорезу вирізають ділянки, де мають бути КМПС, та вставляють їх у другий гельовий блок, проводячи електрофорез в 0,05 М діамшопропановому буфері з рН 9 Внаслідок такого поєднання вдається розділити глікозамшоглікани , а сам гепарин розділити на З фракції, які мігрують в залежності від своєї молекулярної маси Одначе, з суміші кислих глікозаміногліканів виділити тільки гепарин за цим способом не вдається Спосіб дозволяє виділити не менше ніж 0,3-0,5 мкг КМПС Однак, цей спосіб має наступні недоліки 1 Не дозволяє проводити виділення з суміші КМПС тільки гепарин, оскільки за умов електрофорезу визначаються також ІНШІ глікозамшоглікани, що потребує додаткової наявності всіх стандартів для їх ідентифікації 2 Дозволяє проводити виділення та визначення гепарину тільки у вигляді 3 фракцій з різною молекулярною масою, в той час як гепарин являє собою гетерогенну речовину, яка складається з більшої КІЛЬКОСТІ фракцій з різною молекулярною вагон а 3 Спосіб не поширений на визначення гепарину в рослинній сировині В основу винаходу поставлено завдання створити такий спосіб одержання гепарину, який би дозволив з субстрату як рослинного, так і тваринного походження, в якому наявні глікозамшоглікани, виділити за умов різних рН тільки такий глікозамшоглікан як гепарин, враховуючи при цьому гетерогенність гепарину за молекулярною масою Це дозволить розширити джерела гепаринової сировини, використання способу як у промисловості, так і в лабораторній практиці, отримувати як суцільний гепарин, так і більшу КІЛЬКІСТЬ ЙОГО фракцій У відомому способі (2,3) сировиною, в якій наявні глікозамшоглікани, являється сироватка крові, яку попередньо обробляють, проводячи и розведення, та отримують розчин глікозамшогліканової складової, осаджують білок, виділяють глікозаміногліканову фракцію, змішуючи супернатант, в якому наявні глікозамшоглікани, з речовиною-зсідником глікозаміногліканів та отримуючи їх осад, одержують цільовий продукт, розчиняючи глікозамшогліканову фракцію та повторно осаджуючи и етанолом, розчиняючи у воді з додатковим елект 45127 рофоретичним виділенням у поліакриаламідному гелі при поєднанні двох елеісгрофорезів з рН 8,6 та 9,0 в барбітуратному та діамінопропановому буфері ВІДПОВІДНО ДО винаходу задача вирішується тим, що вихідну гепариновмісну сировину тваринного або рослинного походження попередньо висушують при температурі 60-85 град, подрібнюють, отримують з неї гепариновмісну складову шляхом екстрагування в інтервалі рН 1-7,6, а після виділення з неї гепариновмісної фракції, и збирають, витримують при підвищеній температурі до відходження рідини та використовують для виділення цільового продукту, застосовуючи и одноразове розчинення лугом, цикл чередувань осаджень етанолом та розчинень-промивань водою з подальшим висушуванням продукту, а отриманий при цьому супернатант включають у цикл одержання цільового продукту, причому, при одержанні цільового продукту з гепариновмісної фракції, додатково використовують його додаткову очистку або електрофоретичне виділення за умов використання електродного електрофоретичного барбітуратного буферу з рН 8,6 та наявності у розділяючому середовищі буферу з рН від фізіологічних значень і не вище 8,6 та рН суміші, в якій наявний цільовий продукт, що підлягає одержанню, в межах 1-12,5 Приклади виконання способу Приклад 1 Тваринну сировину - легені висушують при температурі 60-85 град, після чого подрібнюють у порошок Цей порошок заливають сольовою буферною сумішшю з рН 7,6 та проводять екстрагування гепариновмісної складової при температурі не нижче 60 град впродовж 2 годин Вилучають супернатант, який змішують з розчином фосфорновольфрамової кислоти та одержують гепариновмісну фракцію, для чого проводять центрифугування та видалення рідини Осад збирають, висушують при температурі 60 град та зберігають Сухий осад, що має рН 1, подрібнюють, змішують з барбітуратним буфером з рН 8,6 та використовують для електрофоретичного виділення гепарину у горизонтальному 5 % поліакриламідному гелі, який виготовлено на буфері з рН 7,6 при використанні барбітуратного електродного буфера з рН 8,6, напруги 160 В та сили струму 40 мА впродовж 40-50 хвилин Надалі гель фіксують, забарвлюють та відмивають, після чого виявляють 5 фракцій гепарину Аналогічно розділяють 10 нг стандарту гепарину Приклад 2 Об'єкт дослідження - шкіру тварини висушують при температурі 60-85 град , після чого подрібнюють у невеликі шматочки, які заливають розчином 0,1 н соляної кислоти при рН 1,0 та проводять екстрагування гепариновмісної складової при температурі не нижче 60 град впродовж 2 годин Вилучають супернатант, який змішують з розчином їдкого натра, барбітуратним буфером з доведенням рН до 12,5 та використовують для електрофоретичного виділення гепарина у 5% поліакриламідному гелі, який виготовлено на буфері з рН 7,6 при використанні барбіту ратного електродного буфера з рН 8,6 Проводять гельелектрофорез при силі струму 40 мА впродовж 40-50 хвилин Навдалі гель фіксують, забарвлюють та відмива ють, після чого виявляють 2 швидкомігруючі фракції гепарину, які порівнюють із стандартом Приклад 3 Рослинну сировину - висушену водорость спіруліну у вигляді порошку заливають сольовою буферною сумішшю з рН 1,6 та проводять екстрагування гепариновмісної складової при температурі не нижче 60 град впродовж 2 годин Вилучають супернатант, який змішують з розчином фосфорновольфрамової кислоти та одержують гепариновмісну фракцію, для чого проводять центрифугування та видалення рідини Осад збирають, витримують при температурі 60 град до відходження рідини з осаду, після чого надлишок вологи вилучають Цей осад розчиняють 1Н розчином їдкого натра, доводять рН до 12,5 з внесенням барбітуратного буферу з рН 8,6 та використовують для електрофоретичного виділення гепарина у 5% поліакриламідному гелі, який виготовлено на буфері з рН 7,6 з використанням барбіту ратного електродного буферу з рН 8,6 та сили струму 40 мА впродовж 40-50 хвилин Надалі гель фіксують, забарвлюють та відмивають, після чого виявляють фракції гепарину, які порівнюють з 2 нг стандарту Приклад 4 Тваринну сировину - легені висушують при температурі 60-85 град, після чого подрібнюють у порошок Цей порошок заливають сольовою буферною сумішшю з рН 7,6 та проводять екстрагування гепариновмісної складової при температурі не нижче 60 град впродовж 2 годин Вилучають супернатант, який змішують з розчином четвертичної амонієвої сполуки - цетилпірідінія хлориду та одержують гепариновмісну фракцію, для чого проводять центрифугування та видалення рідини Осад збирають, висушують при температурі 60 град та зберігають Сухий осад подрібнюють, змішують з барбітуратним буфером з рН 8,6 та використовують для електрофоретичного виділення гепарина у горизонтальному 5 % поліакриламідному гелі, який виготовлено на буфері з рН 7,6 при використанні барбіту ратного електродного буфера з рН 8,6 та сили струму 40 мА впродовж 40-50 хвилин Надалі частину гелю -одну смужку вирізають, фіксують, забарвлюють та відмивають, після чого виявляють 5 фракцій гепарину ВІДПОВІДНО ДО ЗОН локалізації гепарину на цій смужці вирізають ВІДПОВІДНІ ДІЛЯНКИ з гепарином та вилучають з них відомим способом гепарин, наприклад, елююванням Приклад 5 Сировину - шкіру тварини висушують при температурі 60-85 град, після чого подрібнюють у порошок Цей порошок заливають сольовою буферною сумішшю з рН 7,6 та проводять екстрагування гепариновмісної складової при температурі не нижче 60 град впродовж 2 годин Вилучають супернатант, який змішують з розчином цетилперідінію хлориду та одержують гепариновмісну фракцію, для чого проводять центрифугування та видалення рідини Осад збирають, змішують з барбітуратним буфером з рН 8,6 та використовують для електрофоретичного виділення гепарина у горизонтальному поліакриламідному гелі, який виготовлено на буфері з рН 7,6 при використанні барбітуратного електродного буфера з рН 8,6 та сили струму 40 мА впродовж 40-50 хвилин Надалі гель фіксують, забарвлюють та відмивають, після чого виявляють 5-6 фракцій гепарину Приклад 6 Сировину - легені тварини висушу 45127 ють при температурі 60-85 град, після чого подрібнюють у порошок Цей порошок заливають сольовою буферною сумішшю з рН 7,6 та проводять екстрагування гепариновмісної складової при температурі не нижче 60 град впродовж 2 годин Вилучають супернатант, який змішують з розчином фосфорновольфрамової кислоти та одержують гепариновмісну фракцію, для чого проводять центрифугування та видалення рідини Осад збирають, витримують при температурі 60 град до відходження рідини, після чого вилучають надлишок вологи, а оформлений осад змішують одноразово з розчином 1 Н їдкого натра до його розчинення, додають чистий етиловий спирт, витримують у холоді до випадіння осаду, центрифугують, вилучають надосад, неодноразово осад розчиняють та промивають водою, повторно додаючи етанол до випадіння осаду Надосад збирають та надалі його упарюють і включають у цикл одержання гепарину Після 5 розчинень-промивань осаду цільовий продукт - порошок гепарину збирають та висушують Гепарин ідентифіковано шляхом порівняння колориметричного спектру стандарту гепарину з одержаним вказаним способом Розрахункова активність гепарину, отриманого з легенів, становить 140 Од/мг ваги порошку Розроблений нами спосіб одержання гепарину має такі переваги 1 Розширює використання сировини для одержання гепарину 8 2 Розповсюджується як на промислове, так і лабораторне дослідження гепарину 3 Дозволяє виділяти з суміші глікозамшогліканів тільки гепарин 4 Дозволяє отримати 5 фракцій гепарину при використанні оптимальних буферних систем в умовах одного електрофоретичного циклу 5 Дозволяє залучати до виробництва відходи на стадії одержання цільового продукту 6 Умови одержання гепарину дозволяють виділяти структурно неушкоджений гепарин 7 Спосіб дозволяє виділяти зрілі фракції гепарину за умов екстракції у фізіологічних параметрах середовища 8 Чутливість способу становить менше 10 нг гепарину ЛІТЕРАТУРА 1 К А Шевцова Производство отечественного гепарина// В кн Гепарин, физиология, биохимия, фармакология и клиническое применение Наука,Ленинградское отделение Ленинград, 1969 С 183-185 2 Способ определения гликозаминогликанов в сыворотке крови//АС №1352367 - Бюл №42, 15 11 87 3 Bianchim P , Nader H , Takahashi H Fractionation and identification of Heparm and Other Acidic Mucopolysacchandes by a New Descontmuous Electro p ho retic Method //J Chrom, 1980 - v196-p455-462 ДП "Український інститут промислової власності "(Укрпатент) Україна, 04119, Киів-119, вул сім'ї Хохлових, 15 (044) 456-20-90