Спосіб виготовлення препаратів метафазних хромосом курей

Спосіб виготовлення препаратів метафазних хромосом курей, який включає використання як біологічного об'єкта лейкоцитів периферичної крові, взятої стерильно у посуд з гепарином, культивування в поживному середовищі з додаванням фітогемаглютиніну та 10 % ембріональної сироватки великої рогатої худоби при температурі 37 °С в термостаті протягом 48 годин при обережному 3 (Moorched P., Nowell P., Mellman W..T., Battips D.M., Hungeford D.A. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral blood // Exp. Cell Res. - 1960.- Vol. 20. - P.613-616). Відомий спосіб включає використання в якості біологічного об'єкту лейкоцитів периферичної крові, взятої стерильно в стерильні пробірки з гепарином та фітогемаглютиніном М, охолодження при температурі +4°С 30 хвилин, відділення лейкоцитів з плазмою і використання її для культивування в поживному середовищі 199 на соленому розчині Ерла у співвідношенні 1:3, інкубування в термостаті при температурі +37°С протягом 72 годин, зупинку мітозу лейкоцитів в стадії метафази, колхіцином за 1-2 години до завершення інкубування, відмивання клітин лейкоцитів розчином Хенкса та гіпотонічним розчином КСІ (0,3%) з наступним центрифугуванням, фіксацію сумішшю метанол: оцтова кислота (3:1); розкапування відмитих клітин з висоти 15-20см, фарбування 2% розчином Гімза. Недоліки відомого способу полягають в його складності, довготривалості здійснення, високих економічних витратах на матеріали і реактиви, при цьому не завжди вдається досягнути стабільності результатів у отриманні достатньої кількості метафазних пластинок, а також високої якості отриманих препаратів. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється є спосіб виготовлення метафазних хромосом свиней (НУ на корисну модель №4394). Відомий спосіб включає використання в якості біологічного об'єкта лейкоцитів периферичної крові, взятої стерильно з краніальної порожнистої вени в посуд з гепарином, культивування в середовищі Ігла при температурі 37°С в термостаті, припинення мітозу хромосом лейкоцитів колхіцином на стадії метафази за 1,5-2 години до завершення терміну культивування, відмивання клітин лейкоцитів гіпотонічним розчином хлористого калію (0,3%) з наступним центрифугуванням, фіксацію сумішшю метанол:оцтова кислота; виготовлення препаратів розкапуванням відмитих клітин з висоти 15-20см на предметні скла, фарбування 2% розчином Гімза, при цьому для культивування клітин лейкоцитів використовують 0,5мл цільної крові гепаринизованої крові, яку зразу ж після відбору вносять в стерильний посуд з середовищем Ігла, в яке попередньо додатково вводять 10% ембріональної телячої сироватки і культивують у термостаті протягом 48 годин, обережно перемішуючи інкубат двічі на добу. Заявлений спосіб і прототип мають загальні спільні ознаки: обидва способи включають використання в якості біологічниого об'єкта лейкоцитів периферичної крові взятої стерильно у посуд з гепарином культивування в поживному середовищі з додаванням фітогемаглютиніна та 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби при температурі 37 С в термостаті протягом 48 годин при обережному помішуванні інкубату двічі на добу, припинення мітозу хромосом лейкоцитів на стадії метафази додаванням колхіцину за 1-2 години до завершення терміну культивування, відмивання клітин лейкоцитів гіпотонічним розчином (0,35) хлористого калію з наступним центрифугу 45687 4 ванням, фіксацію сумішшю метанол:оцтова кислота (3:1) виготовлення препаратів розкапуванням відмитих клітин з висоти 15-20см на предметні скла, фарбування 2% розчином Гімза. Недоліком відомого способу є те, що він придатний для виготовлення препаратів метафазних хромосом лейкоцитів свиней і не використовується для виготовлення препаратів метафазних хромосом лейкоцитів інших тварин і птахів. Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипа і забезпечує одержання за короткий термін якісних препаратів метафазних хромосом курей в достатній для досліджень кількості. В основу корисної моделі покладено завдання розробити зручний у виконанні, швидкий у здійсненні та економічно вигідний спосіб виготовлення високоякісних препаратів метафазних хромосом курей. Технічний результат досягається тим, що стерильний відбір крові курей здійснюють з крилевої вени в кількості 10мл у стерильні флакони з гепарином (5од гепарину на 1мл крові), в які для культивації попередньо вносять 0,1мл фітогемаглютиніну та 6,5мл поживного середовища 119 на соленому розчині Ерла з додаванням 10% ембріональної бичачої сироватки. Культивування клітин лейкоцитів цільної гепаризованої крові (10мл) курей в ростовому середовищі 199 на соленому розчині Ерла (6,5мл) шляхом інкубування в термостаті при температурі +37°С забезпечує оптимальні умови для росту і поділу хромосом, при цьому додавання до середовища 10% ембріональної бичачої сироватки сприяє склеюванню форменних елементів крові (тромбоцитів і еритроцитів) і забезпечує чистоту культури клітин лейкоцитів, що необхідно для виготовлення якісних препаратів. При зазначених умовах тривалість інкубації 48 годин виявляється оптимальною і забезпечує одержання достатньої кількості високоякісних метафазних пластинок з добрим розкидом хромосом. В зв'язку з вище зазначеним, одержані за заявленим способом препарати мають високу якість, є показовими і з добрим розкидом хромосом. При проведенні заявником патентноінформаційного пошуку знайдено технічне рішення (ПУ на корисну модель №4394), яке містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим способом: використання в якості біологічниого об'єкта лейкоцитів периферичної крові взятої стерильно у посуд з гепарином культивування в поживному середовищі з додаванням фітогемаглютиніна та 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби при температурі 37°С в термостаті протягом 48 годин при обережному помішуванні інкубату двічі на добу, припинення мітозу хромосом лейкоцитів на стадії метафази додаванням колхіцину за 1-2 години до завершення терміну культивування, відмивання клітин лейкоцитів гіпотонічним розчином (0,3%) хлористого калію з наступним центрифугуванням, фіксацію сумішшю метанол:оцтова кислота (3:1) виготовлення препаратів розкапуванням відмитих клітин з висоти 1520см на предметні скла, фарбування 2% розчином Гімза. 5 Однак наявність зазначених суттєвих ознак недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого рішення не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". В джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату: стерильний відбір крові курей здійснюють з крилової вени в кількості 10мл у стерильні флакони з гепарином (5од гепарину на 1мл крові), в які для культивації попередньо вносять 0,1мл фітогемаглютиніну та 6,5мл поживного середовища 119 на соленому розчині Ерла з додаванням 10% ембріональної бичачої сироватки. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію винаходу (корисної моделі) "винахідницький рівень". Заявлений спосіб належить до сільськогосподарської біології, зокрема, біології курей, а саме до цитогенетичних способів дослідження курей і може бути застосований в лабораторіях науководослідних установ, які займаються селекційною роботою в птахівництві, а тому відповідає критерію винаходу (корисної моделі) "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислове придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентноспроможності винаходу (корисної моделі) відповідно до статті 7 розділу II Закону України «Про охорону прав на винаходи і корисні моделі» №1771-III, 2000р. Кров для досліджень беруть стерильним способом з крилевої вени. Місце взяття крові ближче, до ліктьового суглобу, звільняють від пуху, шкіру дезинфікують і проколюють вену. Кров в дозі 10мл відбирають в шприц і переносять в стерильну пробірку із гепарином (5од. гепарину на 1 мл крові). У стерильно перекриті флакони вносять 0,1мл фітогемаглютинін, 6,5мл ростового середовища 199 на соленому розчині Ерла +10% ембріональної бичачої сироватки та 0,5мл гепаризованої крові, струшують і вміщують для культивування у термостат на 48 годин при температурі +37°С. Клітини лейкоцитів культивують протягом 48 годин при температурі +37°С, обережно перемішуючи вмістиме флаконів двічі на добу. У кожний флакон додають до кінцевої концентрації 10 у колхіцину (0,1мл на флакон за 1 годин до закінчення культивування клітин). Починаючи з цього етапу можна працювати у нестерильних умовах. 45687 6 Перемішавши вмістиме флаконів, переливають їх у 15мл центрифужні пробірки. Клітини осаджують центрифугуванням за режиму 1500об/хв протягом 10 хвилин і відбирають надосадову рідину за допомогою пастерівської піпетки. Осад ресуспендують і додають 6мл попередньо нагрітого до 37°С гіпотонічного розчину 0,075М КСІ і ставлять на 40-50 хвилин у термостат при температурі 37°С. Потім центрифугують при 1500об/хв протягом 10 хвилин. Надосадову рідину обережно відсмоктують, осад ресуспендують. До осаду додають 10мл метанол + оцтова кислота (3:1) і вміщують у холодильник на 20 хвилин. Клітини осаджують центрифугуванням при 1500об/хв. протягом 10 хвилин. Надосадову рідину відсмоктують. Фіксатор змінють 2-3 рази з проміжним ресуспендуванням і центрифугуванням клітин. Після третьої зміни фіксатора суспернатант відсмоктують, залишаючи 0,5мл осаду. Препарати метафазних хромосом готують методом розкапування з висоти 15-20см на знежирені вологі охолоджені предметні скельця. Скла підсушують в полум'ї горілки. Препарати фарбують 2% розчином Гімза. Запропонований нами спосіб дозволяє отримати значну кількість метафазних пластинок з добрим розкидом хромосом. Приклад конкретного виконання способу. Ефективність заявленого способу і його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання способу завдання: У АФ «Ватра» Дрогобицького району Львівської області відібрано 20 курей 25 денного віку породи «Хайсекс», які були поділені шляхом аналогів на 2 групи. Із 10 курей 1-ої групи готували препарати метафазних хромосом за відомим способом (прототип). Із 2-ої групи - за заявленим способом з цільної крові курей. В цільну кров, добуту з крилевої вени курей, описаним в розділі 4.1 методом, додавали середовище 199 на соленому розчині Ерла з глутаміном, ембріональну сироватку биків і фітогемаглютинін. Вмістиме пробірки перемішували двічі на добу та інкубували 48 годин. Решта елементів релізації заявленого способу були однаковими при виготовленні препаратів метафазних хромосом за прототипом і новим способом. Перелік технологічних елементів виготовлення препаратів метафазних хромосом лейкоцитів периферичної крові курей за відомим способом (прототип) та заявленим (новий спосіб) наведений в таблиці 1. Аналіз якості одержаних препаратів подано в таблиці 2. 7 45687 8 Таблиця 1 Технологія виготовлення препаратів метафазних хромосом курей за різними способами Етапи виготовлення препаратів Відомий спосіб (прототип) Новий спосіб Відбір крові стерильно в стерильну посу0,5мл у пробірку 10мл у флакон дину з гепарином 5 од на 1мл крові. Культивування: 0,1мл ростове середови- 0,1мл поживне середовище №199 на - додавання фітоаглютиніну, ще Ігла+6,5мл телячої соленому розчині Ерла+10% бичачої - поживного середовища з ембріональної сироватки сироватки сироватки - в термостаті при t=37°C протягом 48год з струшуванням (перемішуванням)вмісту посуди двічі на добу Припинення мітозу хромосом лейкоцитів за 1-2год до кінця культивнесенням колхіцину загальної концентза 1год до кінця культивування вування рації 10 g Відмивання клітин лейкоцитів гіпотонічним розчином 0,3% КСІ центрифугуванням Фіксація відмитих клітин сумішшю метанол: оцтова кислота (3:1) Виготовлення препаратів розкапуванням з висоти 15-20см на підготовлені скла Фарбування 2% розчином Гімза Таблиця 2 Характеристика застосованих способів отримання препаратів хромосом курей Група І (прототип) II новий спосіб Об'єкт дослідження Лейкоцити крові Лейкоцити крові Всього метафазних пластинок 1000 1000 Дані таблиці свідчать, що найбільш оптимальним є отримання метафазних хромосом за новим способом, про що говорить велика кількість аналізабельних метафазних пластинок. Комп’ютерна верстка О. Рябко Якісних 930 1000 Неякісних 70 0 Отже, заявлений нами спосіб забезпечує одержання високоякісних препаратів метафазних хромосом при економії часу на виготовлення і використання реактивів. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601