Застосування сполуки 3-децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксіетил)тіазолій хлорид як сполуки, яка викликає збільшення нестимульованого вивільнення глутамату з нервових закінчень головного мозку щурів

Застосування сполуки 3-децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксіетил)тіазолій хлорид як сполуки, яка викликає збільшення нестимульованого вивільнення глутамату з нервових закінчень головного мозку щурів, загальної формули: H21C10CO2CH2 CH3 + N Cl Корисна модель належить до медицини, а саме до фармакології. Завданням корисної моделі є дослідження дії сполуки 3-децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксиетил)тіазолій хлориду (ДМГТ) H21C10CO2CH2 CH3 + N Cl неративні процеси [1]. Тіамін залучений до контролю процесів квантової секреції нейромедіатора у синапсах різних типів [2-4]. До складу молекули тіаміну входять тіазолієвий та піримідиновий цикли, які поєднані метиленовим містком. Серед біологічно активних речовин в організмі, наявність тіазолієвого циклу є характерною особливістю структури тіаміну та його похідних. Синтезований аналог вітаміну В1 - ДМГТ має непорушений тіазолієвий цикл [5]. Довгий вуглеводневий хвіст у складі ДМГТ сприяє вбудовуванню молекули у фосфоліпідний бішар біологічних мембрани. Ряд властивостей ДМГТ дозволяє розглядати цю сполуку як потенційний лікарський засіб [5-9]. При уведенні в організм лабораторних тварин ДМГТ знижує больову чутливість, пригнічує орієнтувальну та пошукову поведінку, викликає седативний, центральний міорелаксуючий, протисудомний, снодійний ефекти [5]. Було показано, що ця сполука здатна знижувати нейротоксичний вплив білкового токсину a-латротоксину з отрути павука каракурта (Latrodectus mactans tradecimguttatus) [6]. ДМГТ викликає блокування квантової секреції медіатора в міоневральних синапсах у відповідь на подразнення нервових волокон або прикладання a-латротоксину. В дослідах на штучних фосфоліпідних мембранах було встановлено, що ДМГТ U (13) 45942 (11) на нестимульоване вивільнення глутамату з ізольованих нервових закінчень (синаптосом) головного мозку щурів. Вивчення дії ДМГТ на нестимульоване вивільнення глутамату з синаптосом, виділених з головного мозку щурів, проводилося у відділі нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України і на кафедрі біології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. ДМГТ синтезовано у відділі механізмів біоорганічних реакцій Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Вітамін B1 (тіамін) є необхідним для функціонування центральної та периферичної нервової системи ссавців. При недостатності вітаміну В1 в організмі виникають розлади рефлекторної діяльності, координації рухів, розвиваються нейродеге . UA CH2CH2OH CH2CH2OH (19) S S 3 знижує провідності іонних каналів, сформованих в них a-латротоксином, амфотерицином В або ністатином [6, 8, 9]. Було також продемонстровано, що в ізольованих нервових закінченнях головного мозку щурів ДМГТ суттєво пригнічує процес натрій-залежного накопичення глутамату - нейромедіатору, що обумовлює процесі збудження у центральній нервовій системі ссавців [10]. Стимульоване деполяризацією нервових закінчень Са2+-залежне вивільнення з них нейромедіаторів, яке відбувається під час злиття синаптичних везикул з плазматичною мембраною нервових закінчень, є одним з ключових етапів синаптичної передачі. Вивільнений при цьому в синаптичну щілину глутамат зв'язується з мембранними рецепторами та активує відповідні сигнальні шляхи, що забезпечує подальшу передачу сигналу. За відсутності стимуляції нервових закінчень концентрація позаклітинного глутамату є однією з основних характеристик, що визначає спонтанну активність мозку. За нормальних умов концентрація глутамату в синаптичній щілині підтримується на достатньо низькому рівні, що становить менше ніж 1мкМ. Завдяки цьому унеможливлюється надмірна активація іонотропних та метаботропних глутаматних пост- та пресинптичних рецепторів. В той же час надзвичайно важливим для нормального функціонування мозку є процес тонічної активації цих рецепторів позаклітинним глутаматом. Підвищена концентрація глутамату у синаптичній щілині порушує синаптичну передачу та створює підґрунтя для розвитку неврологічних симптомів. Базальне вивільнення глутамату з нервових закінчень, яке відбувається за відсутності їх подразнення, є однім з процесів, що визначає позаклітинну концентрацію глутамату в стані спокою. Беручи до уваги наведені вище дані, є доцільним проаналізувати вплив ДМГТ на нестимульоване вивільнення глутамату з нервових закінчень головного мозку щурів. В основу корисної моделі поставлено те, що ДМГТ викликає збільшення нестимульованого вивільнення радіоактивно міченого L-[14C]глутамату з попередньо навантажених ним препаратів ізольованих нервових терміналей (синаптосом) головного мозку щурів. Нестимульоване вивільнення L[14С]глутамату з синаптосом збільшувалося в присутності ДМГТ у концентрації 100мкМ у середовищі інкубації на 30% у порівнянні з контролем. Дія ДМГТ не залежить від присутності іонів кальцію в середовищі інкубації. Позаклітинний рівень L[14C]глутамату становив в кальційвмісному середовищі за відсутності ДМГТ - 0,235±0,013нмоль/мг білка, в присутності ДМГТ в концентрації 100мкМ в середовищі інкубації упродовж 40хв. 0,290±0,013нмоль/мг білка; а в безкальцієвому середовищі за відсутності ДМГТ 0,231±0,013нмоль/мг білка, в присутності ДМГТ в концентрації 100мкМ - 0,280±0,013нмоль/мг білка. Ознаки способу. Методика виділення нервових закінчень (синаптосом) з головного мозку щурів та визначення вивільнення L-[14C]-глутамату з синаптосом 45942 4 Виділення синаптосом з головного мозку щу рів. Щурів-самців лінії Wistar масою 100-120г декапітували, великі півкулі головного мозку швидко переносили в розчин, що містив 0,32М сахарози, 5мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) та 0,2мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА). Усі операції проводилися при 4°С. Синаптосоми виділяли з гомогенату мозку диференційним центрифугуванням і центрифугуванням в градієнті щільності фіколлу, застосовуючи метод Котмана [11] у такій модифікації: розчин сахарози для приготування градієнту фіколлу містив 5мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2мМ ЕДТА [12]. Синаптосомальну фракцію, отриману при центрифугуванні гомогенату головного мозку в градієнті щільності фіколлу, розводили 10 об’ємами 0,32М сахарози, 5мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2мМ ЕДТА та центрифугували при 20000g упродовж 20хв. Отриманий осад повільно суспендували в 4мл оксигенованого холодного середовища, що містило (в мМ): NaCl - 126, КСl - 5, MgCl2 - 1,4, NaH2PO4 - 1,0, HEPES - 20, СаСl2 - 2, dглюкозу - 10 (pH 7,4). При цьому кінцева концентрація білка становила 4 мг/мл. Синаптосоми використовували в експериментах упродовж 2-4 годин після отримання. Концентрацію білка визначали за методом Ларсона [13]. Визначення вивільнення L-[14С]глутамату з синаптосом. Суспензія синаптосом розводилася стандартним сольовим розчином так, що містила 1мг білка/мл, і після 10хв преінкубації при 37°С навантажувалася L-[14С]глутаматом (500нМ, 238мСі/ммол) (Amersham, Великобританія) в кальцієвому стандартному сольовому розчині упродовж 10хв. Після цього суспензія синаптосом відмивалася 10 об'ємами льодяного стандартного сольового розчину і розводилася до концентрації 1мг білка/мл і відразу використовувалася для визначення вивільнення L-[14С]глутамату з синаптосом. Аліквоти (120мкл; 25-30мкг навантажених L[14С]глутаматом синаптосом), преінкубували 10хв при 37°С. Нестимульоване вивільнення L[14С]глутамату з синаптосом у кальційвмісному середовищі та у безкальцієвому середовищі відбувалося 1-40хв. Через визначений проміжок часу суспензію синаптосом швидко осаджували в мікроцентрифузі, 10000g протягом 20с. Аліквоти надосаду (90мкл) та солюбілізованого додецилсульфатом натрію осаду (90мкл) змішували з синтиляційною рідиною ACS (Amersham, Великобританія) (1,5мл) та визначали радіоактивність за допомогою синтиляційного лічильника Tracor Analytic Delta 300 (США). Загальний вміст радіоактивності визначали як суму радіоактивності у аліквоті надосаду та у аліквоті солюбілізованого осаду. Згідно протоколу дослідження нестимульоване вивільнення глутамату з ізольованих нервових закінчень головного мозку щурів вивчалося з використанням радіоактивно міченого L-[14С]глутамату, яким попередньо були навантажені синаптосоми (див. методику). В наших експериментах спостерігається постійне нестимульоване (базальне) вивільнення L-[14С]глутамату, що є однією з основних 5 характеристик препарату синаптосом (Фіг., суцільна лінія). На теперішній час механізм, завдяки якому L-[14С]глутамат спонтанно вивільнюється з нервових закінчень у синаптичну щілину, остаточно не з'ясовано, але передбачається можливість залучення до цього процесу спонтанного екзоцитозу, аніонних каналів, цистеїн-глутаматного обмінника та трансмембранної дифузії. Було продемонстровано, що прикладання ДМГТ до нервових закінчень призводило до збільшення нестимульованого вивільнення L-[14С]глутамату з синаптосом. На Фіг. (переривиста лінія) представлено динаміку нестимульованого вивільнення L-[14С]глутамату з синаптосом за умови їх інкубації у присутності ДМГТ в концентрації 100мкМ. Показано, що ДМГТ суттєво посилює нестимульоване вивільнення L[14С]глутамату з ізольованих нервових закінчень упродовж 1-35хв (n=5; Р≤0,05). Було показано, що в присутності іонів Са2+ 100мкМ ДМГТ викликає ефект подібний такому, що було зафіксовано у безкальцієвому середовищі. За умови інкубації синаптосом у кальційвмісному середовищі без ДМГТ позаклітинний рівень L-[14С]глутамату становив 0,235±0,013нмоль/мг білка, а з ДМГТ у концентрації 100мкМ упродовж 40хв - 0,290±0,013нмоль/мг білка; а у безкальцієвому середовищі без ДМГТ позаклітинний рівень L-[14С]глутамату становив 0,231±0,013нмоль/мг білка, а з ДМГТ в концентрації 100мкМ упродовж 40хв - 0,280±0,013нмоль/мг білка. Таким чином, дія ДМГТ не залежить від присутності іонів кальцію в середовищі інкубації. Таким чином, слід підкреслити наступне: 1. ДМГТ збільшує нестимульоване вивільнення L-[14С]глутамату з ізольованих нервових закінчень (синаптосом) головного мозку щурів. 2. Внесення ДМГТ у концентрації 100мкМ у середовище інкубації синаптосом обумовлює збільшення нестимульованого вивільнення з них L[14С]глутамату на 30%. 3. Обумовлене ДМГТ посилення нестимульованого вивільнення L-[14С]глутамату з нервових закінчень не залежить від присутності іонів кальцію в середовищі інкубації. Джерела інформації: 1. Bettendorff L. Thiamine in excitable tissues: reflections on a non-cofactor role // Metab. Brain Dis. - 1994. - 9, №3. - P.183-209. 2. Романенко А.В. Действие тиамина на нервно-мышечную передачу у лягушки // Нейрофизиология. - 1985. - 17, №6. - С.794-800. 3. Романенко А.В. Действие тиамина на различные типы синаптических соединений // Нейрофизиология. - 1986. - 18, № 5. - С.621-629. 4. Романенко А.В., Гнатенко В.М., Владимирова И.А.. Действие тиамина на нервно-мышечную передачу в гладких мышцах // Нейрофизиология. 1994. - 26, №6. - С.449-457. 45942 6 5. Вовк А.И., Романенко А.В., Муравьева И.В., Зайцев Л.М. 3-децоксикарбонилметил-4-метил-5β-гидроксиэтилтиазолий хлорид или децоксикарбонилметил-4-метилтиазолий хлорид, угнетающие нервно-мышечную передачу и обладающие транквилизирующей активностью // Авторское свидетельство 1547267 СССР, МКИ4 С07D277/24, А61К31/425. Заявлено 18.07.88. Зарегистрировано 01.11.89. 6. Романенко А.В., Вовк А.И., Шатурский О.Я. Действие тиазолевых аналогов витамина В1 на нервно-мышечную передачу и вызванную αлатротоксином секрецию медиатора в скелетной мышце // Нейрофизиология. - 1995. - 27, № 5/6. - с. 368-374. 7. Романенко А.В., Гнатенко В.М., Владимирова И.А., Вовк А.И. Пре- и постсинаптическая модуляция нервно-мышечной передачи в гладких мышцах тиазолевыми аналогами витамина B1 // Нейрофизиология. - 1995. - 27, №5/6. - С.375-386. 8. Романенко О.В., Вовк А.І., Гіммельрейх Н.Г. Шатурський О.Я. Сполука 3децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2гідроксіетил)тіазолій хлорид, яка має блокувальний ефект на іонну провідність каналів, утворених амфотерицином В. // Патент на корисну модель №22875 зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на корисні моделі 25 квітня 2007р. 8с. 9. Шатурський О.Я. Романенко О.В., Вовк А.І., Гіммельрейх Н.Г. Сполука 3-децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксіетил)тіазолій хлорид, яка має блокуючий ефект на іонну провідність каналів, утворених ністатином. // Патент на корисну модель №27417 зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на корисні моделі 25 жовтня 2007р. - 8с. 10. Борисова Т.О., Крисанова Н.В., Сівко Р.В., Романенко О.В., Вовк А.І. Сполука 3-децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксіетил)тіазолій хлорид, яка має інгібуючий ефект на процес натрій-залежного накопичення глутамату ізольованими нервовими закінченнями головного мозку щурів // Патент на корисну модель №38155 зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на корисні моделі 25 грудня 2008р. - 8с. 11. Cotman C. W. Isolation of synaptosomal and synaptic plasma membrane fractions // Meth. Enzymol. - 1974. - 31. - P.445-452. 12. Borisova T.A., Krisanova N.V. Presynaptic transporter-mediated release of glutamate evoked by the protonophore FCCP increases under altered gravity conditions // Adv. Space Res. - 2008. - 42, N12. - P.1971-1979. 13. Larson E., Howlett В., Jagendorf A. Artificial reductant enhancement of the Lowry method for protein determination // Anal. Biochem. - 1986. - 155. - P.243-248. 7 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 45942 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601