Застосування сполуки 3-децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2-гідроксіетил)тіазолій хлорид як сполуки, яка викликає зменшення протонного градієнта синаптичних везикул в ізольованих нервових закінченнях головного м

Застосування сполуки 3децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2гідроксіетил)тіазолій хлорид як сполуки, яка викликає зменшення протонного градієнта синаптичних везикул в ізольованих нервових закінченнях головного мозку щурів, загальної формули: H21C10CO2CH2 CH3 + N Cl Корисна модель належить до медицини, а саме до фармакології. Завданням корисної моделі є дослідження дії сполуки 3-децилоксикарбо нілметил-4-метил-5-(2гідроксіетил)тіазолій хлориду (ДМГТ) У функціонуванні центральної нервової системи ссавців важливе значення належить тіаміну (вітаміну В і). Дефіцит цього вітаміну супроводжується порушенням рефлекторної діяльності, координації рухів, розвитком нейродегенеративних процесів [І]. Дія тіаміну проявляється у стимуляції процесу квантової секреції нейромедіатора у синапсах різних типів [2-4]. Молекули тіаміну містять у своєму складі тІазолієвий цикл, що є характерним лише для цього вітаміну та його похідних. ДМГТ - синтетичний аналог вітаміну В і, який має непорушений тіазолієвий цикл [5]. Крім того, у складі ДМГТ присутній довгий вуглеводневий хвіст, який, Імовірно, сприяє взаємодії сполуки з мембранними структурами. ДМГТ за багатьма властивостями може розглядатись як потенційний лікарський засіб [5-9]. При уведенні в організм лабораторних тварин ДМГТ викликає седативний, центральний міорелаксуючий, протисудомний, снодійний ефекти, підвищує поріг больової чутливості, послаблює орієнтувальні реакції та пошукову діяльність [5]. ДМГТ також здатен знижувати нейротоксичний вплив білкового токсину а-латротоксину, виділеного з отрути павука каракурта (Latrodectus mactans tradecimguttatus) на лабораторних тварин (11) 45943 (13) U . UA CH2CH2OH (19) на функціональний стан синаптичних везикул в Ізольованих нервових закінченнях головного мозку щурів, а саме на протонний градієнт синаптичних везикул. Вивчення дії ДМГТ на протонний градієнт синаптичних везикул в ізольованих нервових закінченнях головного мозку щурів проводилось у відділі нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України і на кафедрі біології Національного медичного університету імені 0.0. Богомольця. ДМГТ синтезовано у відділі механізмів біоорганічних реакщй Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. S 3 [6]. ДМГТ викликає блокування квантової секреції медіатора в мІоневральних синапсах у відповідь на подразнення нервових волокон або дію алатротоксину [6]. ДМГТ обумовлює зниження іонної провідності каналів, сформованих алатротоксином, амфотерицином В або ністатином в штучних фосфоліпідних мембранах [6, 8, 9]. Нещодавно нами було показано, що ДМГТ має Інгібуючий ефект на процес натрій-залежного накопичення нейромедіатору глутамату ізольованими нервовими закінченнями головного мозку щурів [10]. Необхідно підкреслити, що глутамат відіграє важливу роль у центральній нервовій системі ссавців, обумовлює збудження нервових клітин і бере участь у здійсненні таких важливих функцій головного мозку, як розпізнавання, пам'ять та навчання. Одним з ключових етапів синаптичної передачі є екзоцитоз - стимульовання деполяризацією нервових закінчень, вивільнення нейромедіаторів із синаптичних везикул шляхом злиття останніх з плазматичною мембраною нервових закінчень. Накопичення нейромедіаторів в синаптичні везикули здійснюється спеціальними везикулярними транспортерами нейромедіаторів. Ці транспортери використовують протонний градієнт на мембрані синаптичних везикул як рушійну силу процесу накопичення в них нейромедіатора. Порушення протонного градієнту синаптичних везикул може призвести до зниження концентрації нейромедіатора у везикулах. Внаслідок цього зменшується кількість глутамату, що вивільняється шляхом екзоцитозу при деполяризації плазматичної мембрани нервових терміналей. Оскільки вивільнений з нервових закінчень глутамат зв'язується з мембранними рецепторами та активує відповідні сигнальні шляхи, то зменшення його надходження у синаптичну щілину у відповідь на деполяризацію нервового закінчення може обумовити значні порушення процесу синаптичної передачі. Можливо припустити, що обумовлене ДМГТ блокування викликаної у відповідь на подразнення нервових волокон або дію a-латротоксину квантової секреції медіатора в міоневральних синапсах, пов'язане безпосередньо зі зменшенням наповнення синаптичних везикул нейромедіатором. Беручи до уваги дані, що наведені вище, вважається доцільним проаналізувати вплив ДМГТ на протонний градієнт синаптичних везикул нервових закінчень. В основу корисної моделі поставлено те, що ДМГТ викликає зменшення протонного градієнту синаптичних везикул в препараті ізольованих нервових закінчень (синаптосомах) головного мозку щурів. Синаптосоми попередньо навантажували рН-чутливим флуоресцентним зондом - акридиновим оранжевим (АО), який акумулюється в тих компартментах синаптосом, де значення рН менше ніж 7,0 а саме в синаптичних везикулах. Додавання ДМГТ у середовище інкубації в концентрації 50 - 200 мкМ миттєво викликає вивільнення флуоресцентного зонду з синаптосом. Дія ДМГТ не залежить від присутності іонів кальцію в середовищі інкубації. 45943 4 Методика виділення нервових закінчень (синаптосом) з головного мозку щурів та визначення рівня закислення синаптичних везикул Виділення синаптосом з головного мозку щурів Щурів-самців лінії Wistar масою 100-120 г декапітували, великі півкулі головного мозку швидко переносили в розчин, що містив 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (рН 7,4) та 0,2 мМ етилендІамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА). Усі операції проводилися при 4 °С. Синаптосоми виділяли з гомогенату мозку диференційним центрифугуванням і центрифугуванням в градієнті щільності фіколлу, застосовуючи метод Котмана [11] у такій модифікації: розчин сахарози для приготування градієнту фіколлу містив 5 мМ Hepes-NaOH (рН 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА [12]. Синаптосомальну фракцію, отриману при центрифугуванні гомогенату головного мозку в градієнті щільності фіколлу, розводили 10 об'ємами 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (рН 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА та центрифугували при 20000 g упродовж 20 хв. Отриманий осад повільно суспендували в 4 мл оксигенованого холодного середовища, що містило (в мМ): NaCl - 126, КС1 - 5, MgCb - 1,4, NaH2PO4 - 1,0, HEPES - 20, СаСl3 - 2, d-глюкозу - 10 ( рН 7,4). При цьому кінцева концентрація білка становила 4 мг/мл. Синаптосоми використовували в експериментах упродовж 24 годин після отримання. Концентрацію білка визначали за методом Ларсона [13]. Визначення рівня закислення синоптичних везикул. Для дослідження закислення синаптичних везикул був використаний рН-чутливий флуоресцентний барвник акридиновий оранжевий (АО) (Molecular Probes, США), який селективне накопичується у компартментах з кислим рН (зокрема в синаптичних везикулах) [14]. АО - це ліпофільний амін; непротонована форма якого вільно проникає в мембрану. Він стає мембранонепроникним після протонування в кислому середовищі органел, що мають всередині позитивний заряд. Розподіл АО в синаптосомх залежить від рН. Таким чином, флюоресценція АО, акумульованого в органелах, пропорційна рН у середовищі органели і може свідчити про рушійну силу для наповнення синаптичних везикул нейромедіатором. Зміни інтенсивності флуоресценції реєстрували на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія). При цьому довжина хвилі збудження становила 490 нм, а емісії - 530 нм (спектральна ширина щілини - 5 нм). Накопичення АО синаптосомами реєстрували після додавання АО (кінцева концентрація 5 мкМ) до суспензії синаптосом (кінцева концентрація білка 0,2 мг/мл), при постійному перемішуванні та після преінкубації синаптосомальної суспензії протягом 10 хв. при 37 °С. Закислення синаптичних везикул в синаптосомах визначали по інтенсивності флуоресценції АО згідно формули: F = Ft / F0 де F0 - інтенсивність флуоресценції АО за відсутності синаптосом у кюветі, f( -інтенсивність флуоресценції АО у присутності синаптосом у кюветі. 5 Додавання суспензії синаптосом до розчину АО супроводжується частковим зменшенням флюоресценції внаслідок входу АО в кислі компартменти синаптосом, зокрема синаптичні везикули [14]. Акумуляція АО не є швидким процесом, стабілізація рівня флюоресцентного сигналу проходила упродовж декількох хвилин (Фіг. 1). В безкальцієвому середовищі інкубації синаптосом (Фіг. 1) додавання ДМГТ в концентрації 100 мкМ призводило до вивільнення акумульованого АО і, як наслідок, до суттєвого (на 30 %) збільшення флюоресцентного сигналу, що свідчить про зменшення протонного градієнту синаптичних везикул внаслідок дії ДМГТ. Повторне внесення до середовища інкубації синаптосом ДМГТ в концентрації 100 мкМ призводило до подальшого збільшення флюоресцентного сигналу ще на ЗО %, що свідчить про дозо-залежність ефекту ДМГТ у безкальцієвому середовищі. Дозо-залежний ефект дії ДМГТ було підтверджено при використанні ДМГТ у зростаючих концентраціях (від 50 до 200 мкМ), при цьому нову порцію ДМГТ вносили у середовище інкубації синаптосом після стабілізації рівня флюоресцентного сигналу. Дослідження впливу ДМГТ на протонний градієнт синоптичних везикул в Са2+-вмісному середовищі показано, що в присутності іонів Са ДМГТ в концентрації 100 мкМ викликає ефект подібний тому, що було зафіксовано у безкальцієвому середовищі. Таким чином, дія ДМГТ не залежить від присутності іонів кальцію в середовищі інкубації. Таким чином, слід підкреслити наступне: 1. ДМГТ викликає зменшення протонного градієнту синаптичних везикул в ізольованих нервових закінченнях (синаптосомах) головного мозку щурів. Цей ефект є дозо-залежним. 2. Зниження протонного градієнту синаптичних везикул в ізольованих нервових закінченнях головного мозку щурів на 30 % відбувається при додаванні у середовище інкубації ДМГТ в концентрації 100 мкМ. 3. Дія ДМГТ на протонний градієнт синаптичних везикул в ізольованих нервових закінченнях не залежить від присутності іонів кальцію у середовищі інкубації. Література 1. Bettendorff L. Thiamine in excitable tissues: reflections on a non-cofactor role // Metab. Brain Dis. 1994. - 9, №3. - P. 183-209. 2.Романенко А.В. Действие тиамина на нервно-мышечную передачу у лягушки // Нейрофизиология. - 1985. - 17, №6. - С. 794-800. 3.Романенко А.В. Действие тиамина на различные типы синаптических соединений // Нейрофизиология.- 1986. - 18, №5.- С. 621-629. 4.Романенко А.В., Гнатенко В.М., Владимирова И.А.. Действие тиамина на нервно-мышечную передачу в гладких мышцах // Нейрофизиология. 1994. -26, №6. - С. 449-457. 5.Вовк А.И., Романенко А.В., Муравьева И.В., Зайцев Л.М. 3-децоксикарбонилметил-4-метил-5 45943 6 (3-гидроксиэтилтиазолий хлорид или децоксикарбонилметил-4-метилтиазолий хлорид, угнетающие нервно-мышечную передачу и обладающие транквилизирующей активностью // Авторское свидетельство 1547267 СССР, МКИ4 С 07 D 277/24, А 61 К 31/425. Заявлено 18.07.88. Зарегистрировано 01.11.89. б.Романенко А.В., Вовк А.И., Шатурский О.Я. Действие тиазолевых аналогов витамина В і на нервно-мышечную передачу и вызванную алатротоксином секрецию медиатора в скелетной мышце // Нейрофизиология,-1995.- 27, №5/6.-С. 368-374. 7-Романенко А.В., Гнатенко В.М., Владимирова И.А., Вовк А.И. Пре- и постсинаптическая модуляция нервно-мышечной передачи в гладких мышцах тиазолевыми аналогами витамина В і // Нейрофизиология.-1995.-27, №5/6.-С.375-386. 8. Романенко О.В., Вовк A.I., Гіммельрейх Н.Г. Шатурський О.Я. Сполука 3децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2гідроксіетил)тіазолій хлорид, яка має блокувальний ефект на іонну провідність каналів, утворених амфотерицином В.// Патент на корисну модель № 22875 зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на корисні моделі 25 квітня 2007 p. - 8 с. 9-Шатурський О.Я. Романенко О.В., Вовк A.I., Гіммельрейх Н.Г. Сполука 3децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2гідроксіетил)тіазолій хлорид, яка має блокуючий ефект на іонну провідність каналів, утворених ністатином. // Патент на корисну модель № 27417 зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на корисні моделі 25 жовтня 2007 p. - 8 с. 10. Борисова Т.О., Крисанова Н.В., Сівко Р.В., Романенко О.В., Вовк A.I. Сполука 3децилоксикарбонілметил-4-метил-5-(2гідроксіетил)тіазолій хлорид, яка має інгібуючий ефект на процес натрій-залежного накопичення глутамату ізольованими нервовими закінченнями головного мозку щурів // Патент на корисну модель № 38155 зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на корисні моделі 25 грудня 2008 р.-8 с. 11. Cotman С. W. Isolation of synaptosomal and synaptic plasma membrane fractions // Meth. EnzymoL-1974.- 31. - P. 445-452. 12. Borisova ТА., Krisanova N.V. Presynaptic transporter-mediated release ofglutamate evoked by the protonophore FCCP increases under altered gravity conditions // Adv. Space Res.-2008.-42, N 12.-P. 1971-1979. 13. Larson E., Hewlett В., JagendorfA. Artificial reductant enhancement of the Lowry method for protein determination // Anal. Biochem. - 1986.-155. -P. 243-248. 14. Zoccarato F., Cavallini L., Alexandre A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes // J. Neurochem. -1999.- 72." P. 625-633. 7 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 45943 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601