Спосіб одержання препарату інсуліну короткої дії
Номер патенту: 33796
Опубліковано: 15.02.2001
Автори: Стефанов Олександр Вікторович, Олейнікова Євгенія Адольфівна, Рибчук Віктор Олександрович, Возіанов Сергій Олександрович, Співак Микола Якович, Лазарєв Олексій Павлович, Старовєров Сєргєй Міхайловіч
Текст
Спосіб одержання препарату ін суліну короткої, дії, що включає водно - спиртову екстракцію підшлункової, залози тварин, іонообмінну хроматографію, хроматографічне відділення проінсуліну та інши х баластних білків, розчинення очище ного ін 33796 соляної, кислоти з до бавленням консерванту і гліцерину. ("Ре гламент производства инсулина для инъекций", М.,1382). Основні недоліки методу: невисокий вихід інсуліну, невизначеність якості спиртового екстракту піділункової залози, багатостадійність, трудоємність і енергоємність, неекономічний метод концентрування, дуже низька продуктивність (50 мл/год), використання соляної кислоти, значні витрати високоочище ного інсуліну для приготування його го тової лікарської форми. Ме тою винахо ду є розробка високоефе ктивного, економічного, науковоємного, швидкого і високопродуктивного способу одержання високоочищеного інсуліну сви ней або великої рогатої, худоби з ха рактеристиками субста нції інсуліну: вміст інсуліну - не менше 98,5 - 99,2% (як правило 98,8 99,3%), вміст проінсуліну - не більше 10 ррМ (як правило, 0,5 - 5,0 ррМ), вміст інших ба ластних білків - не більше 1%, і препарату інсуліну короткої, дії: вміст інсуліну ви сокоочище ного сви ного або телячого або їх суміші - 36 - 42 ОД, кислоти оцтової - 0,8 - 1,2 мг, натрію гідроокису - 0,35 - 1,1 мг, гліцерину - 0,01 - 0,02 г, ні пагіну - 0,085 - 1,400 мг або іншо го консерванту, во ди високочищеної - до 1мл. Поставлена мета до сягається тим, що по дрібнену підшлункову залозу екстрагують 60 - 85% ним спирто вим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфо катіонітом, відмивання баластних білків проводять амонійно ацетатним буфером з рН 6,0, а елюцію проводять 0,1 - 1,0 М бікарбонатним буфе ром з рН 6,5 - 9,0. Відділення проінсуліну і інших полімерних білків проводять на сорбенті на основі силікагелю з прище пленими гексадецильними групами, а як елюент використо вують водні розчини з вмістом ізо пропілового спирту (10 - 50%) і оцтової кислоти (0,1 - 5,0%). Очищення від дезамідованих і інших форм інсуліну проводять в градієнті водно - органічного елюенту із вмістом оцтової, кислоти від 0,2 до 0,8%. Приготування препарату інсуліну короткої дії здійснюють шляхом отримання розчину ви сокоочщеного інсуліну з застосуванням спеціальної технології і використанням розчинів кислоти оцтової, натрію гідроокису, гліцерину, консерванту ти пу ніпагі ну. Суть способу заключається в дво - тристадійній обробці підшлункової залози: - на першій стадії, видаляють основні баластні білки шляхом водно - спиртового екстрагування підшлункової, залози з наступною іонообмінною хроматографі єю на колонці з сульфокаті онітом і елююванням 0,1 - 1,0 М бі карбонатним буфе ром з рН 6,5 - 9,0, що дозволяє підвищи ти на 5 - 12% вихід інсуліну, одержують інсулін - сирець з вмістом інсуліну на рівні 90 - 93%, - на другій стадії, видаляють проінсулін і полімерні білки хроматографією розчину інсуліну - си рцю, що містить ізопрспиловий спирт і оцтову кислоту, на колонці (10х30 см) з Діасорбом - 130 С16Т, 20 мкм. Елюювання здійснюють тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використо вують фотометр при довжині хви лі 280 нм і довжиною опти чного шляху кювети 0,5 мм. Далі інсулін можна кристалізувати і висушивати до вмісту во ди не більше 10%, одержуючи (вихід не менше 80%) кристалічний інсулін з вмістом основної, речовини не менше 95% і вмістом проінсуліну - не більше 5 ррМ. - на третій стадії, інсулін, одержаний на стадії 2, вносять в розчин, що містить 5 - 50% етанолу (ацетонітрилу, ізопропілового спирту) і 0,1 - 5,0% оцтової, кислоти. Наносять на колонку (15х30 см), упаковану сорбентом Діасорбом - 130 - С16Т з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 год із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 12% етанолу, 0,3% оцтової, кислоти у во ді; буфер Б: 50% етанолу, 0,3% оцтової, кислоти. Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ). Після аналізу об'єднують фракції, з вмістом інсуліну не менше 98%. Об'єднані фракції, інсуліну криста лізують (вихід не менше 90%) і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують кристалічний інсулін з вмістом основної, речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 5 ррМ, дезамідова них форм інсуліну - не більше 0,3%, високомолекулярних білків - не бі льше 0,3%. Фракції, з вмістом основної речовини від ЗО до 98% об'єднують і накопичують для наступної переробки за стадією 3. - на четвертій стадії отримують препарат інсуліну короткої дії шляхом спеціальної технології розчинення кристалічного ви сокоочищеногс інсуліну з ви користанням компонентів у такому співвідношенні; ну короткої дії: вміст інсуліну ви сокоочище ного свиного або телячого або їх суміші – 36 42 ОД, кислоти оцтової - 0,8 - 1,2 мг, натрії гідроскису 0,35 - 1,1 мг, глі церину - 0,01. - 0,02 г, ніпагіну - 0,085 - 1,400 мг або іншого консерванту, води високоочище ної - до 1мл. Основні переваги запропонованого способу порівняно з прото типом: - зменшено кількість операцій: одна операція при виділенні і дві операції при очищенні цільового продукту, що в свою чергу значно здешевлює весь процес і скорочує в 180 (!) разів час його проведення; - на першій стадії, робочі об'єми зменшуються практично у 15 разів, що спрощує те хнологію і суттєво полегшує до тримання санітарних норм виробництва; - вміст білкових домішок в інсуліні, одержаному запропонованим способом, набагато нижче, ніж у кращи х зразках закордонного виробництва. - препарат інсуліну короткої, дії забезпечує високу терапевтичну ефе ктивність, стабільність розчину, його м'яку дію, надійність дії консерванту і повну нетоксичність останнього. Ме тод простий і оригінальний в реалізації, не потребує значної кількості дорогокоштуючого обладнання. Запропонований спосіб видрізняється значною наукоємністю, як за видом матеріалів і обладнання, що використовується, так і за змістом і типом технологічних операцій. Приклад . Одержання високоочище ного препарату монокомпонентного інсуліну короткої, дії,. Стадія 1. 0,4 - 1,0 тони підшлункової залози свиней, подрібнюють, екстрагують 60 - 85% спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баласт 2 33796 ні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфо каті онітом КУ - 23 або Macro Prep high S support, Bio - Rad USA, 50 мкм, відмивку баластних білків проводять амоній - ацетатним буфером з рН 6,0, елюювання здійснюють 0,5М б і карбонатним буфе ром (рН 7,5). Проводять кристалізацію і висушують до залишкової во лого сті 10%. Одержують 100 г кристалічного інсуліну з вмістом основної, речовини 92%. Стадія 2. 100 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 1, розчиняють в 10 л розчину, що містить 10 % ізопропілового спирту і 0,3 7с. оцтової, кислоти та наносять на колонку діаметром 10 см, довжиною ЗО см, заповнену сорбентом Діасорб - 130 - С16Т, 20 мкм. Елюювання проводять тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густи ною. Як детектор використовують фотометр при довжині хви лі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Інсулін кристалізують і висушують до вмісту води не більше 10%. Оде ржують 80 г (вихід 80%) криста лічного інсуліну з вмістом основне і речовини 95% і вмістом проінсуліну 5 ррМ. Стадія 3. 80 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 2, розчиняють в 9 л розчину, що містить 8% етанолу (або ацетонітрилу чи ізопропілового спирту) і 0,3% оцтової кислоти. Наносять на колонку 15х30 см, запаковану со рбентом Діасорб - 130 - С16Т з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфе ра А+Б за 5 годин із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 15% етанола, 0,3% оцто вої кислоти у во ді (17 л), буфер Б: 50% етанола, 0,3% оцтової, кислоти у во ді (17 л). Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною ВЕРХ. Пі сля аналізу об'єднують фракції, а вмістом інсуліну не менше 98%. Одержують 72 г (вихід 90%) кристалічного інсуліну з вмістом основної, речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 1 ррМ, деза - мідованих форм - не більше 0,3%, інсуліну ВРХ - не більше 0,2%, високомолекулярних білків - не більше 0,2%. Фракції, із вмістом основної, речови ни від 30 до 98% об'єднують і накопичують для наступної переробки за стадією 3. Стадія 4. 72 г високоочищеного інсуліну порціями розчинюють в 0,005 - 0,05 М оцтовій кислоті з доданням води для ін'єкцій (рН 3,0 - 3,5). Отриманий розчин інсуліну змішують поступово з розчином 20% - ного гліцерину, 3 - 5% - ного ніпагіну та 1 - 5% - вого розчину на трію гідроокису і до водять загальний об'єм розчину до 48 - 53 літрів, який потім направляють на стерилізуючу фільтрацію. Простерилізований розчин інсуліну надалі стерильно розливають у флакони або пенфі ли, інші користувачі, та ук упорюють їх. Потім здійснюють контроль, маркування, упаковку гото вої продукції, (препарату ін суліну короткої дії). Отриманий таким чином препарат інсуліну короткої, дії під назвою "моносуінсулін МК" або "МК суінсулін кор" має наступний склад: вміст інсуліну високоочищен ного (свиного або телячого або їх суміші) – 36 - 42 ОД (характеристика субста нції, інсуліну: вміст інсуліну - не менше 98,5 - 99,2 % (як правило 98,8 - 99,3%), вміст проінсуліну - не більше 10 ррМ (як правило, 0,01 - 5,0 ррМ), вміст інши х баластних білків - не більше 1 - 2%), кислоти оцтової - 0,8 - 1,2 мг, натрію гідроокису 0,35 - 1,1 мг, гліцерину - 0,01 - 0,02 г, ніпагіну 0,085 - 1,400 мг або іншого консерванту, во ди виоокочищеної - до 1мл. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ - 133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295 - 81 - 42, 295 - 61 - 97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл. - вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ - 39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268 - 25 - 22 ___________________________________________________________ 3
ДивитисяДодаткова інформація
Автори англійськоюLazariev Oleksii Pavlovych, Stefanov Oleksandr Viktorovych, Spivak Mykola Yakovych, Vozianov Serhii Oleksandrovych, Rybchuk Viktor Oleksandrovych
Автори російськоюЛазарев Алексей Павлович, Стефанов Александр Викторович, Спивак Николай Яковлевич, Возианов Сергей Александрович, Рибчук Виктор Александрович
МПК / Мітки
МПК: A61K 38/28
Мітки: спосіб, препарату, короткої, інсуліну, дії, одержання
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/3-33796-sposib-oderzhannya-preparatu-insulinu-korotko-di.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб одержання препарату інсуліну короткої дії</a>
Попередній патент: Спосіб одержання інсуліну
Наступний патент: Спосіб одержання препарату інсуліну середньопролонгованої дії
Випадковий патент: Спосіб формування опорно-рухової кукси у хворих після евісцерації очного яблука з приводу травм і уповільнених увеїтів