Спосіб одержання водорозчинного грибного меланіну

Спосіб одержання водорозчинного грибного меланіну, що включає кип'ятіння протягом 2 годин суспензії меланіну в розчині їдкого натрію, фільтрацію, осадження розчинених фракцій меланіну соляною кислотою, фільтрацію осадженого меланіну, розчинення його в розчині їдкого натрію, розливання в ампули і стерилизацію, який відрізня ється тим, що меланін кип'ятять в 25-30-кратній КІЛЬКОСТІ 1 н розчину їдкого натрію, меланін, що не розчинився, промивають на фільтрі 10-кратною КІЛЬКІСТЮ гарячої (80-90°С) води, розчинені в лугові фракції меланіну осаджують концентрованою соляною кислотою при рН 1-2, суміш витримують без перемішування протягом 6 годин, відфільтрований меланін, не промиваючи, підсушують протягом З годин вакуумом на фільтрі, суспендують в теплій воді, розчиняють суспензію за допомогою 1 н розчину їдкого натрію до рН 5,7 ± 0,4, розчин кип'ятять протягом 1 години, фільтрують, розводять очищеною водою в об'ємі, необхідному для одержання потрібної концентрації, додають натрій хлорид до одержання ІЗОТОНІЧНОГО розчину, фільтрують через фільтр "Міліпор" з d = 0,45 мкм, стерилізують при 100 °С протягом ЗО хвилин О Винахід відноситься до хіміко-фармацевтичної промисловості, зокрема до способів одержання водорозчинних меланінів Вихідним продуктом для одержання водорозчинного меланіну є меланін, продукований грибом рослинного походження Cladosponum Cladosponoides 396 (продуцентштамм гриба Cladosponum Cladosponoides 396 захищений а с 1063834А, заявлено на спосіб одержання меланіну з біомаси гриба, р н 97126128) Відомо, ЩО меланіни є гетерополімерами, які мають гідроксильні, карбоксильні і карбонільні групи, і що вони мають властивості поліанюнів [1, 2] Молекулярний склад меланінів неоднорідний і вони можуть бути розділені з допомогою стандартного методу [2, 4] на чотири фракції, які відрізняються фізико-хімічними властивостями Проте, всі чотири фракції не розчиняються в воді, що спричиняє складності при одержанні готових лікарських форм із меланіну і проведенні фармакологічних експериментів ВІДОМІ два способи одержання водорозчинного меланіну, одержуваного із гриба Pullulana prototropha [5, 6] Суть методу [5] полягає в розчиненні меланіну в незначній КІЛЬКОСТІ 0,5 - 1% розчину їдкого калію або їдкого натрію Від надлишку катіонів натрію і калію позбавляються при допомозі діалізу проти дистильованої води до постійного рН, близького до значення 7 Потрібну концентрацію пігменту одержують розбавленням основного розчину водою Згідно способу [5] одержують водні розчини натрієвої або калієвої солі меланіну Спосіб дорогий і не має ЦІННОСТІ для виробництва у зв'язку з відсутністю промислового обладнання для проведення діалізу Близьким до способу, що заявляється, є спосіб [6], згідно якого меланін суспендують в 10 об'ємах 0,5 н, їдкого натру, суспензію кип'ятять на протязі 2 годин, частину, що не розчинилась, ВІДДІЛЯЮТЬ центрифугуванням, а пігмент меланіну висаджують підкисленням соляною кислотою до рН 4,0 Осад промивають водою до нейтральної реакції, потім етанолом, ацетоном та сушать Наважку меланіну розчиняють в невеликій КІЛЬКОСТІ 0,59% розчину їдкого натрію, а потім з допомогою соляної кислоти встановлюють рН 7,0 Потрібну концентрацію меланіну одержують розбавленням отриманого розчину фізіологічним розчином Одержаний колоїдний розчин меланіну ступінчато сте 00 (О 46798 рилізують Так як меланіни різних продуцентів, окрім загальних властивостей, які дозволяють ідентифікувати їх і віднести до класу "справжніх меланінів", мають свої особливості, то і способи одержання з них розчинних в воді препаратів повинні враховувати специфічні особливості конкретного меланінового пігменту В основу винаходу поставлено завдання розробки промислового способу одержання розчинного в воді препарату меланіну, виділеного з біомаси гриба Cladosponum Cladosponoides 396, який за рахунок умов розчинення меланіну, сукупності і ПОСЛІДОВНОСТІ операцій по видаленню білковоліпідно-полісахаридних залишків зруйнованої клітини дозволив би одержати розчин меланіну - глибокоочищений, стійкий при зберіганні - при мінімальних економічних витратах і технологічній простоті процесу Поставлене завдання вирішується тим, що меланін, виділений з гриба Cladosponum Cladosponoides 396, кип'ятять з 1 н розчином їдкого натрєю, суспензію фільтрують, меланін, що не розчинився, промивають очищеною водою, фільтрати об'єднують Додаванням до об'єднаного фільтрату концентрованої соляної кислоти до рН = 1 - 2 висаджують розчинені фракції меланіну, відокремлюють їх від маточника фільтрацією, після чого знову суспендують в невеликій КІЛЬКОСТІ очищеної води, суспензію, підігрівають до 40 - 50°С і розчиняють меланін добавленням 1 н розчину їдкого натрію до рН 5,7 ± 0,4, розчин кип'ятять на протязі 1 години, охолоджують, фільтрують, фільтрат розбавляють очищеною водою до потрібної концентрації і добавляють розраховану КІЛЬКІСТЬ хлориду натрію, до ізотони розчину Технічний результат, що досягається здійсненням винаходу, полягає в одержанні високочистого, стабільного при зберіганні колоїдного розчину натрієвої солі меланіну при незначних матеріальних затратах Спосіб здійснюється наступним шляхом Суспензію меланіну в 25 - 30-кратній КІЛЬКОСТІ 1 н розчину їдкого натрію кип'ятять із зворотним холодильником на протязі 1,5 2,5 години, охолоджують до ЗО ± 5°С і фільтрують Нерозчинений меланін на фільтрі промивають 10-кратною КІЛЬКІСТЮ гарячої (85 ± 5°С очищеної води Фільтрати об'єднують До об'єднаного фільтрату додають концентровану соляну кислоту до рН 1 - 2 Суміш перемішують на протязі ЗО хвилин і витримують без перемішування на протязі 6 годин Зкоагульований меланін фільтрують і підсушують витримуванням на нутч-фільтрі на протязі 3 годин Одержану пасту меланіну знову суспендують в теплій (45 ± 5°С) очищеній воді у співвідношенні 1 60 До отриманої суспензії добавляють 1 н розчин їдкого натрію до рН = 5,7 ± 0,4 Суміш кип'ятять на протязі 1 години зі зворотним холодильником, охолоджують до ЗО ± 5°С і фільтрують Розчин розбавляють очищеною водою до потрібної концентрації, розчиняють в ньому натрій хлористий до ізотони розчину, фільтрують через фільтр "Міліпор" з d = 0,45мкм, розливають в ампули темного скла і стерилізують при 100°С на протязі ЗО хви лин Приводимо конкретні приклади здійснення винаходу Приклад 1 В реактор з мішалкою, зворотним холодильником і термометром загружають 35г меланіну і ЮООмл 1 н розчину їдкого натрію Суспензію гріють при перемішуванні до кипіння і витримують на протязі 2 годин Після закінчення витримки суспензію охолоджують до 35°С і фільтрують Меланін, що не розчинився, промивають на фільтрі 350мл гарячої (90°С) очищеної води Фільтрати об'єднують Із об'єднаного фільтрату осаджують меланін подачею при перемішуванні концентрованої соляної кислоти до рН 1 Меланін випадає в вигляді пластівців, які розподіляються у всьому об'ємі суміші Суміш перемішують на протязі ЗО хвилин, перевіряють рН, виключають перемішування і залишають відстоюватись на протязі 6 годин Зкоагульований у вигляді щільного шару внизу реактора меланін відфільтровують і підсушують на фільтрі вакуумом на протязі 3 годин Пасту меланіну суспендують в 600мл очищеної води, підігрітої до 50°С Суспензію перемішують на протязі 20 хвилин і розчиняють меланін додаванням 1 н розчину їдкого натру до рН = 5,7 Одержаний розчин меланіну нагрівають до кипіння і витримують на протязі 1 години, після чого охолоджують до 30°С і фільтрують Визначають вміст меланіну в розчині і догружають очищену воду в об'ємі, необхідному для одержання 1% розчину меланіну В одержаному розчині визначають вміст хлоридів і догружають потрібну КІЛЬКІСТЬ хлориду натрію до ізотони розчину Розчин фільтрують через фільтр "Міліпор" з d = 0,45мкм Одержують 1180 мл 1% розчину меланіну в вигляді його натрієвої солі Розчин розливають в ампули темного скла і стерилізують при 100°С на протязі ЗО хвилин Приклад 2 В реактор з мішалкою, зворотним холодильником і термометром загружають 35г меланіну і 900мл 1 н розчину їдкого натру Суспензію гріють при перемішуванні до кипіння і витримують на протязі 2 годин Після закінчення витримки суспензію охолоджують до 30°С і фільтрують Не розчинений меланін на фільтрі промивають 350мл гарячої (85°С) очищеної води Фільтрати об'єднують Із об'єднаного фільтрату осаджують меланін подачею при перемішуванні концентрованої соляної кислоти до рН 1,5 Суміш перемішують ЗО хвилин, перевіряють рН і залишають відстоюватись без перемішування на протязі 6 годин Меланін відфільтровують і підсушують на фільтрі вакуумом на протязі 3 годин Пасту меланіну суспендують в 600мл очищеної води, підігрітої до 50°С Суспензію перемішують на протязі 20 хвилин і розчиняють меланін додаванням 1 н розчину їдкого натру до рН = 5,6 Одержаний розчин меланіну нагрівають до кипіння і витримують на протязі 1 години, після чого охолоджують до 30°С і фільтрують Визначають вміст меланіну в розчині і догру 46798 жають очищену воду в об'ємі, необхідному для одержання 1% розчину меланіну В одержаному розчині визначають вміст хлоридів і догружають потрібну КІЛЬКІСТЬ натрія хлориду до ізотони розчину Розчин фільтрують через фільтр "Міліпор" з d = 0,45мкм Одержують 1050мл 1% розчину меланіну в вигляді його натрієвої солі Розчин розливають в ампули темного скла і стерилізують при 100°С на протязі ЗО хвилин Приклад З В реактор з мішалкою, термометром і зворотним холодильником загружають 35г меланіну і 950мл 1 н розчину їдкого натру Суспензію нагрівають при перемішуванні до кипіння і витримують на протязі 1,5 годин Після закінчення витримки суспензію охолоджують до 35°С і фільтрують Нерозчинений меланін на фільтрі промивають 350мл гарячої (80°С) очищеної води Фільтрати об'єднують Із об'єднаного фільтрату висаджують меланін подачею при перемішуванні концентрованої соляної кислоти до рН 2 Суміш витримують без перемішування на протязі 6 годин Меланін відфільтровують і підсушують на фільтрі вакуумом на протязі 3 годин Пасту меланіну суспензують в 600мл очищеної води, нагрітої до 50°С Суспензію перемішують на протязі 20 хвилин і розчиняють меланін подачею 1 н розчину їдкого натру до рН 5,9 Одержаний розчин меланіну нагрівають до кипіння і витримують на протязі 1 години, після чого охолоджують до 30°С і фільтрують Визначають вміст меланіну в розчині і догружають очищену воду в об'ємі, необхідному для одержання 1% розчину меланіну В одержаному розчині визначають вміст хлоридів і догружають потрібну КІЛЬКІСТЬ натрія хлориду до ізотони розчин Розчин фільтрують через фільтр "Міліпор" з d = 0,45мкм Одержують 1100мл 1% розчину меланіну в вигляді його натрієвої солі Розчин розливають в ампули темного скла і стерилізують при 100°С на протязі ЗО хвилин Таблиця Порівняльний аналіз способу, що заявляється і прототипу Прототип 1 Суспендування меланіну в 0,5 н, розчині їдкого натру при співвідношенні реагентів мелнін 1 0,5нЫаОН 10 2 Кип'ятіння на протязі 2 годин 3 Фільтрація 4 Осадження меланіну соляною кислотою при рН 4,0 5 Фільтрація меланіну Спосіб, що заявляється 1 Суспендування меланіну в 1н, розчині їдкого натру при співвідношенні реагентів мелнін 1 iHNaOH 2 5 - 3 0 2 Кип'ятіння на протязі 2 годин 3 Фільтрація 4 Осадження меланіну соляною кислотою при рН 1 -2 5 Витримка без перемішування на протязі 6 го 6 Промивка водою, дин спиртом, ацетоном 6 Фільтрація меланіну 7 Підсушування вакуу7 Сушіння мом на фільтрі 8 Розчинення мела- 8 Суспендування меланіну в 0,59% розчині ніну у воді і розчинення додаванням до водної їдкого натрію 9 Підкислення розчи- суспензії 1н розчину їдну меланіну соляною кого натру до рН = 5,7 ± 0,4 кислотою до рН 7,0 10 Приготування "фі- 9 Кип'ятіння на протязі 1 зіологічного" розчину години (100 °С) 11 Розбавлення оде- 10 Фільтрація ржаного колоїдного розчину натрієвої солі 11 Загрузка води в об'необхідному для меланіну "фізрозчи- ємі, одержання потрібної ном" до потрібної концентрації концентрації 12 Розлиття в ампули 12 Загрузка хлориду натрію до ізотони розчину 13 Стерилизація 13 Розлиття в ампули 14 Стерилизація Сукупність і ПОСЛІДОВНІСТЬ операцій процесу, що заявляється, величини режимів і параметрів, що заявляються, а також співвідношення компонентів достатні і необхідні для досягнення поставленого у винаході завдання Співвідношення реагентів, що заявляються (меланін, розчин їдкого натрію), а також концентрація розчину їдкого натрію визначені експериментально Загрузка меншої КІЛЬКОСТІ розчину їдкого натру спричиняє неповне вилучення розчинних в лузі фракцій меланіну Збільшення КІЛЬКОСТІ розчину їдкого натру не доцільне з економічних міркувань, через те, що не призводить до збільшення виходу меланіну При використанні менш концентрованого розчину їдкого натрію має місце неповне вилучення розчинних у лузі фракції меланіну Використання більш концентрованого розчину їдкого натру небезпечно в аспекті теоретично можливої деструкції меланіну Промивка нерозчинної в лузі фракції меланіну гарячою водою проводиться з метою повного вилучення з нього розчинних фракцій Температура очищеної води і и КІЛЬКІСТЬ підібрані експериментально При зменшенні температури води на промивку, а також при зменшенні и КІЛЬКОСТІ, З меланіну на фільтрі (що має, завдяки своїй фізичній природі, подібну до пилу структуру і, внаслідок цього, утворює на фільтрі дуже цільний шар) не повністю вилучаються розчинені в лузі фракції і зменшується вихід меланіну Спосіб, що заявляється, дозволяє одержати високочистний колоїдний розчин натрієвої солі меланіну потрібної концентрації ЛІТЕРАТУРА 1 С П Лях, Я Л Рубан Досягнення мікробіологи, №5, 90(1968) 2 С П Лях, Я Л Рубан Мікробні меланіни, М 1972 3 С П Лях, Я Л Рубан ВІДОМОСТІ АН СРСР Сер "БІОЛОГІЯ", №4, 530(1968) 4 А А Малама, Г Б Храменко, П А Буланов, А Я Рубенчик Мікробіологія, 43, вип 3,453(1974) 5 А А Малама, П А Буланов ДАН БРСР, 9, № 9, 7 46798 8 627(1965) 7 А А Малама Вплив методу приготування роз6 А А Малама Хараісгеристика гриба Pullulana чинів меланінових пігментів на їх біологічну активprototropa, одержання з нього полісахариду і меність Матеріали до II з'їзду біохіміків Лит РСР, ланіну і вплив даних біополімерів на пухлину ЕрліВільнюс, 1975 ха, автореф канд десерт - Мінськ, 1968 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71