Штам ентомопатогенних бактерій bacillus thuringiensis 994 для одержання біопрепарату проти листоїдів

Штам ентомопатогенних бактерій Bacillus thunngiensis 994 (колекція Інституту сільськогосподарської мікробіологи УААН, № Е-82) для одержання біопрепарату проти листоїдів виражене у активному рості на середовищах з амонійними солями, на МПА Антигенні властивості дає позитивну реакцію джгутикового антигену з типовою сироваткою Bacillus thunngiensis subsp thunngiensis H-l в розведенні 1 8000 Штам продукує ентомоцидний ендотоксин, який виділяється із клітин в процесі лізису їх оболонок, і екзотоксин, що продукується в період вегетативного росту культури Ентомоцидна активність штаму Bacillus thunngiensis 800 (І_с!50млн спор / мл) по відношенню до личинок листоїдів молодшого віку складає ВІДПОВІДНО колорадського жука 9,2 американського білого метелика 10,9 капустяного білана 14,3 Технічним результатом винаходу є підвищення ефективності технологічності і розширення спектру дії бактеріального препарату, розробленого на основі штаму ентомопатогенних бактерій проти листоїдів сільськогосподарських культур Недоліки, які перешкоджають використанню Bacillus thunngiensis 800 як ефективного штаму для створення на його основі біопрепарату, культивування на складних органомінеральних середовищах, - низька швидкість досягнення стадії зрілості культури, - титр спор рідкої культури штаму 800 в 0,5-1,2 рази менший, ніж титр спор рідкої культури штаму 994, що є важливим при розробці і застосуванні біопрепарату В основу винаходу поставлена технічна задача одержання штаму ентомопатогенних бактерій групи Bacillus thunngiensis, який може бути викори ю (О 62542 олого-бюхімічні ознаки штаму Добре розвивається на середовищах з органічним азотом, зокрема МПА, солями амонію Штам 994 активно засвоює сахарозу, манозу, целобіозу, глюкозу, саліцин, ескулін Гідролізує крохмаль, використовуючи цитрати На жовткових середовищах відтворює лецитиназу, пігменту і уреази не відтворює На твердих та рідких середовищах штам 994 росте в межах 20-35°С, температурний оптимум становить 25-32°С Ріст бактерій спостерігається в діапазоні рН7,0-8,3, а оптимальною реакцією середовища є 7,2-7,6 Ознаки штаму СТІЙКІ Антигенні властивості штаму дає позитивну реакцію джгутикового антигену з типовою сироваткою Bacillus thurmgiensis subsp thurmgiensis H-l Культуру зберігають на скошеному м'ясо-пептоному агарі при температурі 3-5°С, пересіваючи один раз на рік Склад середовища для довгострокового зберігання штаму м'ясні кубики - 0,4%, пептон -1,0%, NaCI - 0,5%, агар - 2,0%, вода - 1л рН - 7,2-7,4 Ентомопатогенні властивості штаму штам Bacillus thurmgiensis 994 володіє ентомоцидною активністю для комах ряду Coleoptera і Lepidoptera Рекомендований для боротьби з личинками і гусеницями листоїдів молодшого віку, зокрема колорадського жука Штам не є патогенним для теплокровних тварин і людини Бютехнолопчна характеристика штам 994 продукує ентомоцидний ендотоксин, який звільняється із клітин в процесі лізису їх оболонок, і екзотоксин, що продукується в процесі вегетативного росту культури Ld 50 штаму (млн спор/мл) по відношеню до гусениць американського білого метелика і капустяного білана складає 8,9-17,2, для личинок колорадського жука - 12,3 Рідка культура штаму Bacillus thurmgiensis 994 є Ентомопатогенні спектр дії штаму 994 пошиосновою для розробки біопрепарату Маточну рюється на листоїдів - ШКІДНИКІВ капусти культуру бактерій вирощують в колбах ЕрлейЗазначена перерахована вище сукупність сутмейєра на рідкому поживному середовищі, яке тєвих ознак штаму Bacillus thurmgiensis 994 підскладається з 2,0% кукурудзяного екстракту, 1,5% тверджує можливість одержання очікуваного техмеляси, води водопровідної, рН 7,3-7,7 Маточне нічного результату середовище засівають суспензією спор, вирощеХарактеристика штаму бактерій Bacillus них на м'ясо-пептоному агарі та шкубують в терthurmgiensis 994 Номенклатурні дані рід - Bacillus, мостабільній качалці при 28-32°С, 220об/хв , провид - Bacillus thurmgiensis 994, депонований у котягом 13-15 годин Титр колонієутворюючих лекції Інституту сільськогосподарської мікробіологи одиниць (КУО) маточної культури повинен бути не УААН під реєстраційним номером Е-82 Похоменшим 1,5-2,0x108 в 1мл Маточну культуру викодження штаму штам Bacillus thurmgiensis 994 одеристовують для засіву поживного середовища для ржаний в Південному філіалі Інституту сільськогоодержання рідкої спорової культури Як поживне сподарської мікробіологи УААН з комах природних середовище використовують середовище такого ж популяцій Спосіб виділення штам Bacillus складу, як і при одержані маточного матеріалу thurmgiensis 994 виділений в Південному філіалі Середовище засівають в об'ємі 1% від об'єму сеІнституту сільськогосподарської мікробіологи УАредовища Культивування проводять в скляних АН в 1987 році мікробіологічним методом Кузнєцобанках об'ємом Зл з 0 5л середовища на техноловою Л М і Колбасовою В В з гусениць кільчатого гічних качалках при 28-30°С, 220об/хв , протягом шовкопряда Malacosoma neustna L Ними штам 46-48 годин Після закінчення культивування рідка був ідентифікований по визначнику Берп (1974), культура містить в основній своїй масі ВІЛЬНІ споBarjac, Bonnefoi (1968), Lusenco (1963) і порівняри, титр яких складає 1,0-1,5млрд в 1 мл, включенний із типовим штамом бактерій Bacillus ня ендотоксину і 0,4мг/мл екзотоксину thurmgiensis 800 Культурально -морфологічні ознаки штаму такі Клітини добової культури палиЛабораторне визначення ентомоцидної чкоподібні з закругленими кінцями, розмір клітин активності рідкої препаративної форми штаму 994 від 0,6-1,0 до 3,0-6,Омкм Рухомі завдяки джгутипроводили на личинках колорадського жука, гусекам (перитрихи), грампозитивні Утворюють спори, ницях американського білого метелика і капустябілковий кристалічний ендотоксин і термостабільного білана Корм (листя картоплі, клена, капусти ) ний екзотоксин На МПА утворюють сірувато-білі обробляли водяною суспензією бактерій, потім круглясті плоскі, слабко шорсткі колонії зі злегка підсаджували по 25 комах ( в 3-х разовому повтозавитими краями Діаметр колоній 2,0-3,5мм ФІЗІстано для розробки біопрепарату проти листоїдів на стадії активного живлення Поставлена технічна задача вирішена шляхом виділення з природних популяцій комах Криму нового ефективного штаму Bacillus thurmgiensis 994 Штам 994 має такі співпадаючі зі штамомнайближчим аналогом властивості - штами 994 і 800 виділені з комах природних популяцій на м'ясо-пептонному агарі (МПА), - бактерії рухливі, мають перитрихіальне розташування джгутиків, кристало- і спороутворюючі, грампозитивні, - як джерело азоту штами використовують мінеральні і органічні форми азоту, як джерело вуглецю - різні форми вуглеводів, - штами 994 і 800 здатні синтезувати термостабільний екзотоксин, - штами 994 і 800 мають широкий спектр ентомопатогенної дії проти листоїдів Штам 994 має такі відрізняльні ознаки Морфологічні і фізюлого-бюхімічні розміри вегетативних клітин штаму 994 на стадії добової культури від 0,6-1,0 до 3,0-6,0мкм Штам 994 слабо використовує неорганічні форми азоту По активності утворення екзотоксину екзотоксиногенність штаму 994 по LK 50 для кімнатної мухи складає 5 4мкл/г корму, штаму 800-5,0мкл/г корму Технологічні експоненціальна фаза росту штаму 994 на стадії вегетативних клітин переходить до стаціонарної через 13-14 годин культивування, тоді як у штаму 800 - через 16-17 годин Культура нового штаму досягає технологічної зрілості через 36 годин, а штам-800 - через 40 годин 62542 pi) Для порівняння досліджували також штам 800 Результати приведені в Таблиці 1 Таблиця 1 Ld 50 /млн спор в мл/ для гусениць і личинок Штам Колорадського Американського Капустяного жука білого метелика білана 994 9,0 8,3 9,2 800 9,2 10,9 14,3 Дані Таблиці 1 свідчать, що для гусениць американського білого метелика і капустяного білана Комп'ютерна верстка Н Лисенко штам 994 майже в 1,5 рази перевищує ефективність штама 800 Бактеріальна суспензія штаму 994 має антифідантну дію пошкодженість корму після обробки не перевищувала 5%, контрольні (без обробки) 7 рослини були пошкоджені на 80-95% Фізіологічна дія бактеріальної суспензії штаму 994 проявлялася також в зниженні ваги на 25-82% і розмірів на 25-60% дослідних комах в порівнянні з контрольними після 10-ти діб досліду Таким чином, запропонований новий штам бактерій Bacillus thunngiensis subsp thunngiensis є більш ефективним і технологічним, має широкий спектр дії Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119