Спосіб прискореного та екологічно безпечного контролю ростових властивостей сухого живильного середовища для культивування мікобактерій

Спосіб прискореного та екологічно безпечного контролю ростових властивостей сухого живильного середовища для культивування мікобактерій, що включає розчинення сухого середовища стерильною дистильованою водою та стерилізацію (коагуляцію) його в апараті АСІС з подальшим контролем його біологічної активності (ростових властивостей), який відрізняється тим, що як культури тест-штамів використовують культури не патогенних для тварин атипових мікобактерій М scrofulaceum, М mtracellulare, М fortuitum та вакцинний штам БЦЖ (BCG) О Винахід, що передбачається, відноситься до ветеринарної мікробіологи та біотехнологм Повільний ріст є одним з головних таксономічних ознак збуднику туберкульозу Культивування штаму М bovis на існуючих щільних елективних живильних середовищах триває 8-12 тижнів, що є досить довгим терміном, тому створення нових та вдосконалення існуючих діагностичних засобів бактеріологічної діагностики є актуальною задачею, рішення якої прискорить постановку діагнозу на туберкульоз Існують живильні середовища - Живильне середовище для виділення мікобактерій туберкульозу, сухе (середовище Левенштейна-Ієнсена) (ФС 42-250ВС-89) 1990), Сухе живильне середовище для культивування мікобактерій (ТУУ 4615 063-95) ВІДОМІ також середовища Гельберга, Петран'яні, Фінн-2, ФАСТ ЗЛ та ІНШІ (Ветеринарная микробиология - М, "Колос" -1982, Ходун Л М Фреда ФАСТ-ЗЛ для ускоренного выделения микобактерий 49440 туберкулеза//Ветеринария -1996 - №8 С 51-52) Існують методи визначення елективності та біологічної активності (ростових якостей) названих вище сухих живильних середовищ Ростові властивості Сухого живильного середовища для культивування мікобактерій визначають шляхом висіву 0,1см3 мікробної суспензії збудника туберкульозу бичачого (Valle) та людського (H37RV) видів з розведень 10 5-10 6 мг/см , а також проб патологічного матеріалу від хворих на туберкульоз тварин Пробірки з висівами парафінують, переносять в термостат для культивування при 37°С протягом 60 діб Врахування росту колоній проводять через кожні 7-10 діб після висіву Для контролю Живильного середовища для виділення мікобактерій туберкульозу, сухого (середовище Левенштейна-Ієнсена) використовують тест-культуру збуднику туберкульозу людського виду штам H37RV Розведення мікобактерій штаму H37RV роблять таким чином Стерильним бактеріологічним шпателем знімають з живильного середовища бактеріальну масу кожної культури тест-штамів вміщують її у окремий стерильний флакон з бусами, попередньо зважений на аналітичних вагах Флакони з бактеріальною масою знову зважують на аналітичних терезах Різниця між вагою флакона з культурою і порожнього є вагою наважки бактеріальної маси Наважку бактеріальної маси гомогенізують у флаконі з бусами в стерильному фізрозчині (рН 7,0+0,2) з розрахунку 1см3 фізрозчину на 1мг бакмаси По 1см3 одержаної зависі кожного виробничого штаму переносять в пробірки, в які попередньо вливають по 9см 3 стерильного ІЗОТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію Таким чином одержують розведення 10 По 1см3 цього розведення кожної тест-культури переносять в другу пробірку з 9см 3 фізрозчину, з другої пробірки 1см3 суміші переносять в третю, з третьої - в четверту з 9см 3 фізіологічного розчину, в якій одержують розведення 10 4 3 четвертого розведення кожної виробничої культури по 1см3 зависі переносять в п'яту пробірку з 9мл фізрозчину, одержуючи таким чином розведення 10 При виготовленні кожного наступного розведення використовують окрему стерильну піпетку, а мікробні суміші ретельно змішують Завись бактеріальної маси культури H37RV з розведень 10 3 ,10 4 ,10 5 висівають на поверхню щільного живильного в 10 пробірок по 0,1см3 в кожну Пробірки поміщають в термостат в нахиленому положенні на 24 години Через 24 години пробки пробірок з посівами над вогнем спиртівки занурюють в пробірки й заливають розплавленим парафіном Посіви шкубують в термостаті при +37°С протягом 4 тижнів Проглядають посіви через 3-5 діб Недоліками приведених способів контролю живильних середовищ є те, що вони досить тривалі, а для їх виконання необхідно використовувати патогенні для людей та тварин збудники туберкульозу В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу розробити спосіб прискореного та екологічно безпечного контролю ростових властивостей сухого живильного середовища для культивування мікробактерій шляхом розчинення сухого середовища стерильною дистильованою водою та стерилізацію (коагуляцію) його в апараті АСІС з подальшим контролем його біологічної активності (ростових властивостей), при цьому в якості культур тест-штамів використовують культури не патогенних для тварин атипових мікобактерій М scrofulaceum, М mtracellulare, М fortuitum та вакцинний штам БЦЖ (BCG), щоб забезпечити прискорений та екологічно безпечний контроль Для виконання поставленого завдання в якості культур тест-штамів при контролі ростових властивостей сухого живильного середовища для культивування мікобактерій використовували не патогенні для тварин культури атипових мікобактерій М scrofulaceum, M mtracellulare, М fortuitum та вакцинний штам БЦЖ (BCG) Контролем були висіви на тільне живильне середовище дослідних серій культур тест-штамів М bovis (Valle), M tuberculosis (H37RV) Висів культур тест-штамів здійснювали з розведень 10 510 6 Розведення мікобактерій робили таким чином Стерильною бактеріологічною петлею знімали з живильного середовища бактеріальну масу кожної культури тест-штамів і вміщують и у окремий стерильний флакон з бусами, попередньо зважений на аналітичних вагах Флакони з бактеріальною масою знову зважують на аналітичних вагах Різниця між вагою флакона з культурою і порожнього є вагою наважки бактеріальної маси Наважку бактеріальної маси гомогенізували у флаконі з бусами в стерильному фізрозчині (рН 7,0±0,2) з розрахунку 1см фізрозчину на 1мг бакмаси По 1см3 одержаної зависі кожного виробничого штаму переносили в пробірки, в які попередньо вливали по 9см 3 стерильного ІЗОТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію Таким чином одержували розведення 10 По 1см3 цього розведення тест-культури кожної переносили в другу пробірку з 9см фізрозчину, з другої пробірки 1см3 суміші переносять в третю, з третьої- в четверту з 9см 3 фізіологічного розчину, в якій одержували розведення 10 4 3 четвертого розведення кожної виробничої культури по 1см3 зависі переносили в п'яту пробірку з 9мл фізрозчину, а з п'ятої - в шосту, одержуючи таким чином розведення 10 5 та 10 При виготовленні кожного наступного розведення використовували окрему стерильну піпетку, а мікробні суміші ретельно змішували Завись бактеріальної маси культур H37RV, Valle, BCG та атипових М scrofulaceum М mtracellulare, M fortuitum з розведень 1 0 5 т а 10 висівали на поверхню щільного живильного в 10 пробірок від кожної дослідної серії сухого живильного середовища для культивування мікобактерій по 0,1см3 в кожну В дослідах випробували по 10 серій сухого живильного середовища, виготовлених в 1994, 1995, 1996, 1999 та 2001 роках Пробірки поміщали в термостат в нахиленому положенні на 24 години 49440 Через 24 години пробки пробірок з посівами заливали розплавленим парафіном Посіви шкубували в термостаті при +37°С протягом 4 тижнів Проглядали посіви через 3-5 діб Результати досліджень наведені в таблиці Приклад 1 За описаною вище методикою проводили висів культур штамів М bovis (штам Valle) та людського виду (штам H37RV) з розведень 10 -10 6 мг бактерійної маси в 1см3 фізрозчину на щільне живильне середовище, виготовлене в різні терміни з 40 серій "Сухого живильного середовища для культивування мікобактерій" Результати досліджень наведені в таблиці Матеріали таблиці свідчать про те, що початок первинного та інтенсивного росту культур тест-штамів бичачого (штам Valle) та людського (штам H37RV) видів, що за технічною документацією передбачені для контролю ростових якостей сухого живильного середовища відзначали в притаманні кожному виду мікобактерій терміни Патогенні мікобактерії (Valle та H37RV) інтенсивно репродукували і розвивались на живильному середовищі у притаманні для кожного виду терміни Таким чином, сухе живильне середовище, для культивування мікобактерій забезпечує ріст культур тест-штамів притаманні для кожного виду терміни Приклад 2 За описаною методикою проводили висів культур вакцинного штаму М bovis (BCG) з розведень 10 5 -10 6 мг бактерійної маси в 1см фізрозчину на щільне живильне середовище, виготовлене в різні терміни з 40 серій "Сухого живильного середовища для культивування мікобактерій" Контролем були висіви тест-мікобактерій бичачого (штам Valle) та людського (штам H37RV) видів Результати досліджень наведені в таблиці Матеріали таблиці свідчать про те, що терміни росту патогенних мікобактерій (штам Valle) й авірулентних вакцинного штаму БЦЖ статистичне не відрізняються (Р0,05), ніж у збудників туберкульозу При цьому, незважаючи на ВІДМІННОСТІ в термінах росту, всі атипові й патогенні мікобактерії інтенсивно репродукували і розвивались на живильному середовищі у притаманні для кожного виду мікроорганізмів терміни Таким чином, сухе живильне середовище, для культивування мікобактерій забезпечує ріст культур повільнозростающих (патогенних М bovisValle, M tuberculosis-H37RV та авірулентних БЦЖ) та атипових (М mtracellulare, М fortuitum М scrofulaceum) мікобактерій в притаманні для кожного виду терміни Атипові мікобактерії (М mtracellulare, M fortuitum M scrofulaceum) ростуть на живильних середовищах достовірно швидше (Р