Спосіб лікування травматичного ушкодження периферійних нервів у щурів

Спосіб лікування травматичного ушкодження периферійних нервів у щурів, що включає застосування лікарського препарату, який відрізняється тим, що відразу після оперативного втручання призначають впродовж десяти днів ліпофлавон в дозі 0,012мг/кг підшкірно в ділянці нижньої третини стегна. (19) (21) u201002124 (22) 26.02.2010 (24) 10.06.2010 (46) 10.06.2010, Бюл.№ 11, 2010 р. (72) ХРАПАЙ ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ 3 гомогенного сполучнотканинного рубця. Ці процеси, в свою чергу, що сприяють оптимізації формування функціонально ефективних нейродесмальних структурних утворень відновленого периферійного нерва. Аналіз даних літератури дає підстави зробити висновок, що суттєвим чинником поліпшення процесів відновлення після травматичного ушкодження нерва є в першу чергу застосування різних засобів терапії. Багато робіт присвячено вивченню механізму дії і ефективності клінічного використання різних груп медикаментозних засобів, які стимулюють ріст регенеруючих аксонів, поліпшують процеси обміну речовин у регенеруючих нервових волокнах, а також відновлення нейронм'язевих взаємодій в посттравматичному періоді. Разом з тим, залишаються недостатньо вивченими особливості перебігу процесів відновлення нерва, запалення і утворення сполучної тканини при травмі периферійного нерва. В літературі зазначається, що на цей час реєструється низька ефективність фармакотерапії, комбінованого використання хірургічної нейропластики і найбільш ефективних фармакологічних засобів. Це поставило перед дослідниками питання про пошук і використання інноваційних фармакологічних засобів для вирішення проблеми, та розробку сучасних методів їх доставки або аксонального транспорту в різні відділи регенеруючого нерва препаратів в зону травматичного ушкодження. Одним із інноваційних підходів до вирішення проблеми є використання ліпофлавону, тобто розробленої І запропонованої в Україні ліпосомальної форми кверцетину для лікування травматичного ушкодження периферійних нервів за різних способів введення і варіантів терапевтичного використання. Оскільки для флавоноїдів характерний певний механізм антиоксидантної дії та високий рівень безпеки, було доречно вивчити їх вплив у ліпосомальній формі, що забезпечує розчинність та біодоступність комплексу при травмі периферійного нерва. Застосування запропонованої моделі полягає в моделюванні травматичного ушкодження нерва та використання лікарських засобів та препаратів на процеси регенерації (включаючи процес мієлінізації) та процес дегенерації нервових стовбурів та показників, які дозволяють оцінити цей вплив і покращити ефективність фармакотерапії даного захворювання. Позитивні результати досягаються застосуванням лікарського препарату, використовуючи запропоновану нами модель, відразу після травмування нерва щодобово впродовж 10 діб. Всі досліджувані препарати і лікарські засоби вводили тваринам підшкірне в ділянці нижньої третини стегна. Ліпофлавон (Биолек, Харків) вводили в дозі 0,012мг/кг, корвітин (Борщагівський хімікофармацевтичний завод, Київ) - 0,5мг/кг, ліпін (Биолек, Харків) - 0,5мг/кг, лідокаїн (Здоров'я, Харків) 0,1мг/кг. Найбільш близьким до способу, що заявляється є спосіб застосування ліпіну у щурів з пошкодженим периферійних нервів, який обраний нами в 50619 4 якості прототипу (10). Однак цей спосіб має недоліки: - вивчався вплив тільки на процес мієлінізації новоутворених нервових волокон, не звергаючи увагу на процес дегенералізації, що йде попереду процесу регенерації. - відсутні відомості про вплив ліпіну на якість новоутвореного мієліна за рахунок не тільки збільшення товщини мієлінової оболонки, але і збільшення кількості пластин мієліну на одиницю товщини останньої. - введення ліпіну підшкірно не завжди є оптимальним шляхом введення лікарського засобу в клінічних умовах. Задача корисної моделі, що заявляється полягає в розробці способу, який пердбачає застосування препарату, що ефективно впливав би одночасно на декілька ключових процесів регенерації та процес дегенерації нервових стовбурів та показників, які дозволяють оцінити цей вплив і покращити ефективність фармакотерапії даного захворювання. Технічний результат, який досягається полягає у позитивному впливі ліпофлавону не лише на швидкість регенерації осьових циліндрів нерва, а також на процес відновлення структури мієлінової оболонки мієлінізованих нервових волокон. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі лікування травматичних ушкоджень, що включає застосування лікарського препарату, згідно корисної моделі, відразу після оперативного втручання призначають впродовж десяти днів ліпофлавон в дозі 0,012мг/кг підшкірно в ділянці нижньої третини стегна. Спосіб здійснюється наступним чином: Дослідження проведені на 116 білих щурах обох статей вагою 180-250г. Експериментальні тварини були розподілені на 4 групи (табл.1). В контрольну групу тварин увійшли інтактні тварини (n=7), псевдооперовані (n=6), тварини з травматичним ушкодженням сідничного нерва та наступним розчавленням його проксимального відділу (n=9) та тварини з ушкодженням нерва з використанням 2% лідокаїну (n=10). Першу дослідну групу складали тварини з аксотомією та наступним використанням ліпофлавону в перші 10 днів. Термін досліду складав відповідно 3 тижні (n=10), 6 тижнів (n=10) та 12 тижнів (n=11). Друга група - оперовані тварини (з аксотомією), яким вводили корвітин та ліпін впродовж перших десяти днів після травматичного ушкодження нерва. Термін досліду - 3 тижні (n=10), 6 тижнів (n=10) та 12 тижнів (n=11). Третю групу склали дві групи тварин з експериментальне виконаною аксотомією, яким вводили ліпофлавон впродовж десяти днів (з тридцять другого по сорок другий день експерименту) після хірургічного і травматичного ушкодження нерва (n=14) (термін досліду 12 тижнів), а також протягом десяти днів (з тридцять другого по сорок другий день експерименту) після травматичного ушкодження нерва (n=8) (термін досліду 12 тижнів). 5 50619 6 Таблиця 1 Розподіл тварин за групами залежно від термінів дослідження Група Контрольна 1 2 3 Термін дослідження (тижні) Інтактні тварини (n=7), Псевдооперовані тварини (n=6), Хірургічна аксотомія сідничного нерва (n=9, загинуло 2), Аксотомія з наступним використанням лідокаїну (n=10) Аксотомія з наступним використанням ліпофлавону (n=31, загинуло 9) Аксотомія з наступним використанням корвітину і ліпіну (n=31, загинуло 3) Аксотомія з наступним використанням ліпофлавону (n=22, загинуло 10) Оперативні втручання на тваринах проводили в умовах загальної анестезії, використовуючи інгаляційне ефір для наркозу або розчин тіопенталу натрію в дозі 60мг/кг, із дотриманням правил асептики та антисептики. Для виконання світлооптичної мікроскопії сідничного нерва, останні фіксували у 10%-му розчині нейтрального формаліну. Зрізи товщиною 10-20μ імпрегнували азотнокислим сріблом та фарбували за методом Шпільмейєра [6]. МорфометричнІ дослідження, в основі яких лежать принципи стереометрії [7], проводили за допомогою напівавтоматичного пристрою для обробки графічних зображень (UTHSCSAImageТооl, Version 2.0 (alpha 3) для Microsoft Windows 95, Windows NT). У дослідженні визначали такі величини: об'єм волокон в об'ємі нерва (%), кількість нервових волокон в одиниці об'єму нерва, (мкм3), площу поперечного зрізу нервового волокна (мкм2), площу поперечного зрізу осьового циліндру (мкм2), товщину мієлінової оболонки (мкм). При статистичному аналізі морфометричних даних обчислювали середні значення величин, середнє квадратичне відхилення. Порівняння отриманих результатів проводили за допомогою непараметричного критерію Манна-Вітні-Вілкоксона [8]. Препарати тонких і напівтонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопу Olympus BX 51 (Японія). Для електронномікроскопічного дослідження невеликі фрагменти дистальних, проксимальних фрагментів сідничого нерва та зони діастазу фіксували в 1% розчині чотирьохокису осмію протягом 2 годин при температурі +4°С. Об'єкти зневоднювали в розчинах етанолу зростаючої концентрації, в оксипропілені та ацетоні і заливали в суміш епону 812 з аралдитом М (Уіклі, 1975) [9]. Ультратонкі зрізи одержували на ультратомі Райхарт (Голландія), потім їх контрастували в 2% розчині уранілацетату в 70%-му етанолі протягом 30 Термін введення досліджуваних препаратів (дні) 12 3, 6, 12 0-10 3, 6, 12 0-10 12 32-42 (n=14), 0-10, а також 3242 (n=8) хвилин і цитратом свинцю (стільки ж часу). Підготовлені зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ЕМ-400Т Philips (Голландія). Для аналізу результатів електронної мікроскопії за допомогою морфометрії були визначені такі показники: товщина мієлінової оболонки нервових волокон, кількість пластин мієліну. Експериментальне моделювання аксотомії сідничого нерва тварин здійснювали в такий спосіб: виконували оперативний доступ із задньої поверхні стегна, відокремлювали і мобілізували лівий сідничий нерв. Потім нерв перетинали на рівні його середньої третини. Проксимальний відділ нерва на відстані 3-5мм попередньо розчавлювали. Епіневральними швами з'єднували проксимальний і дистальний кінці сідничого нерва, залишаючи діастаз приблизно 1,7-2мм. Нейрорафію проводили із використанням стерильних ниток 10/0 на атравматичній голці за допомогою монофіламентних ниток (проленових або етиленових) фірми "Ethicon" (Шотландія). Після цього рану зрошували розчином антибіотиків (Біцилін-3, "Київмедпрепарат") і зашивали наглухо. Рани у тварин після операції загоїлись первинним натягом. Тварини знаходились у віварії на звичайному раціоні, у досліджуваних групах спостерігали летальні випадки. При вивченні всіх досліджуваних відділів травмованого сідничого нерва встановлено, що лікарський засіб Ліпофлавон впливає не лише на швидкість регенерації осьових циліндрів нерва, а, також, на процес відновлення структури мієлінової оболонки мієлінізованих нервових волокон. Так зростання кількості ламел мієліну достовірно зростає в проксимальному відділі та в зоні травми (р