Спосіб діагностики аутоімунних захворювань печінки

1 Спосіб діагностики аутоімунних захворювань печінки, який включає використання непрямої реакції імунофлуоресценцм, який відрізняється тим, що для одночасного виявлення всього спектра специфічних для цих захворювань циркулюючих в крові аутоантитіл контрольні і ДОСЛІДНІ дослідження проводять одночасно, використовують банк сироваток крові хворих з раніше встановленими діагнозами первинного біліарного цирозу печінки і аутоімунного гепатиту 1-го і 2-го типів з чітко типованими специфічними аутоан титілами, зрізи обробляють сироваткою крові пацієнта в розведенні не менше 1 40, як тестоб'єкти використовують крюстатні зрізи нирки і стінки шлунка білого лабораторного щура 2 Спосіб діагностики по пункту 1, який відрізняється тим, що у випадках імунозабарвлення ядер клітин і/або цитоплазми гладком'язевих клітин стінки шлунка діагностується аутоімунний гепатит 1готипу 3 Спосіб діагностики по пункту 1, який відрізняється тим, що при імунозабарвленні цитоплазми епітеліальних клітин проксимальних звивистих канальців нефронів нирки встановлюється аутоімунний гепатит 2-го типу 4 Спосіб діагностики по пункту 1, який відрізняється тим, що при імунозабарвленні епітеліальних клітин прямих канальців нефронів нирки розпізнається первинний біліарний цироз печінки Винахід належить до медицини, а саме до способів діагностики, і може бути використаний для виявлення хронічного аутоімунного гепатиту ( АГ ), первинного біліарного цирозу печінки ( ПБЦ ) і поєднань АГ з ПБЦ та АГ з вірусними гепатитами Відомо, ЩО АГ - це тяжке захворювання печінки, яке зустрічається у 13% хворих на криптогенний гепатит, у 10% хворих на хронічний гепатит вірусної етіології, у 10% хворих на алкогольний гепатит, у 8% хворих на ПБЦ, а також у 6% хворих на первинний склерозуючий холангіт [ 1 ] В бюптатах печінки хворих на АГ виявляються ознаки хронічного запалення, яке протікає з молеподібним некрозом паренхіми та інтенсивною клітинною інфільтрацією портальних полів Патологічний процес неухильно прогресує і завершується розвитком цирозу печінки, що визначає високу смертність серед пацієнтів Рання діагностика захворювання і своєчасне призначення імунодепресантних препаратів відвертає перебіг хронічного гепатиту в цироз печінки [ 2 ] Для виявлення початкових стадій АГ важливе значення має визначення в сироватці крові хворих циркулюючих аутоантитіл антинуклеарних антитіл ( ANA ), антитіл до цитоплазми гладком'язевих клітин ( SMA ) і антитіл до печінково-ниркового мікросомального антигену (LKM ) [ 3 ] ПБЦ привертає до себе увагу в зв'язку із зростаючою захворюваністю і тяжкими наслідками хвороби Аутоімунний генез захворювання вважається достовірно встановленим Патоморфолопчні ознаки ПБЦ включають в себе прояви 4-х послідовних стадій розвитку патологічного процесу 1 Стадія негнійного деструктивного холангіту 2 Стадія дуктулярної проліферації з новоутвореннями жовчних канальців і подальшою їх деструкцією, порушенням пограничних пластинок портальних трактів і ступінчатим некрозом періпортальних гепатоцитів 3 Стадія рубцювання з розвитком фіброзних септ, які виходять з портальних трактів в печінкові дольки 4 Стадія розвитку цирозу печінки з холестазом на фоні зменшення числа жовчних канальців Для діагностики ПБЦ важливе значення має виявлення типових для даного захворювання змін в імунному статусі хворих, а саме виявлення в сироватці крові антимітохондріальних аутоантитіл (АМА ), вироблення яких відзначено у 95% хворих на ПБЦ [ 4 ] CO Ю 51131 Тяжкий перебіг аутоімунних захворювань печінки і високі показники летальних наслідків диктують необхідність пошуку і удосконалення способів ранньої їх діагностики Актуальною в цьому плані є розробка специфічних, високочуттєвих, стандартних і простих методів імунопстохімічної діагностики Способи діагностики аутоімунних захворювань печінки ВІДОМІ Зокрема існує метод, запропонований R Graber з співавторами, який дозволяє легко виявити АМА і LKM-антитіла з допомогою твердофазного імуноферментного аналізу [ 5 ] Результати цього методу добре узгоджуються з даними імунофлуоресцентного виявлення специфічних аутоантитіл на крюстатних зрізах нирки лабораторних тварин Однак недоліком способу є неможливість розпізнавання ANA і SMA A J Czaja з співавторами розробили методику виявлення ANA [ 6 ] Однак запропонована методика не виявляє всього спектра аутоантитіл, специфічних для аутоімунних захворювань печінки Прототипом способу діагностики який заявляється послужив метод виявлення аутоімунних захворювань печінки запропонований М L Astion з співавторами [ 7 ] Згідно з цим методом, специфічні аутоантитіла, циркулюючі в крові хворих, розпізнаються з допомогою непрямої реакції імунофлуоресценцм На завершальному етапі дослідження результати імунозабарвлення крюстатних зрізів нирки і шлунка лабораторної миші, оброблених сироваткою крові досліджуваного хворого, порівнюють з комп'ютерною (віртуальною) картиною імунозабарвлення аналогічних тест-об'єктів, оброблених антитілами хворих ПБЦ та АГ 1-го і 2-го типів Основним недоліком запропонованого методу є обмеженість його використання і високу собівартість В основу даного винаходу покладене завдання розробити такий спосіб діагностики аутоімунних захворювань печінки, який легко відтворюється і стандартизується, не потребує використання дорогої апаратури і точно розпізнає АГ, ПБЦ і їх поєднання Поставлене завдання, що до предмету винаходу, досягається тим, що увесь спектр специфічних для АГ і ПБЦ антитіл розпізнається на основі порівняльної оцінки картини імунофлуоресцентного забарвлення крюстатних зрізів нирки і стінки шлунка білого лабораторного щура, оброблених сироваткою крові досліджуваного хворого, з картиною імунофлуоресцентного забарвлення аналогічних тест-об'єктів, шкубованих з аутоантитілами хворих з раніше встановленими діагнозами ПБЦ і АГ 1-го і 2-го типів При співставленій способу діагностики, який заявляється, з методом-прототипом виявлені загальні ознаки - як тест-об'єкти використовують крюстатні зрізи нирки і шлунка лабораторних тварин, - для виявлення циркулюючих аутоантитіл застосовують метод непрямої імунопстохімічної реакції, - результати імунозабарвлення тест-об'єктів, оброблених сироваткою крові досліджуваного хворого, порівнюють з картиною імунозабарвлення тест-об'єктів, шкубованих з сироваткою крові здо рових осіб, яка не містить аутоантитіл (негативний контроль), і з сироватками крові хворих ПБЦ і АГ 1о і 2-го типів, які містять специфічні для даних захворювань аутоантитіла (позитивний контроль) ВІДМІТНІ ознаки способу діагностики, який заявляється, від методу-прототипу - контрольні дослідження проводяться одночасно з дослідними, на серійних зрізах одних і тих же органів, однієї і тієї ж лабораторної тварини, з дотриманням єдиних умов постановки імунопстоХІМІЧНИХ реакцій, - для контрольних досліджень використовують не комп'ютерну базу даних, а банк сироваток крові хворих з раніше встановленими діагнозами ПБЦ и АГ 1-го і 2-го типів, з чітко типованими специфічними аутоантитілами, - як тест-об'єкти використовують крюстатні зрізи нирки і стінки шлунка білого лабораторного щура Спосіб діагностики, який заявляється, здійснюється таким чином 1 На раніше приготовані слайд-препарати, які являють собою прикріплені до предметного скла крюстатні зрізи нирки і стінки шлунка білого лабораторного щура, наносять 30-50мкл забуференого фізіологічного розчину ( ЗФР ), рН - 7,4 2 Через 5 хвилин із зрізів видаляють надлишок ЗФР і на слайд-препараги наносять розбавлену в 20, 40, 80 і 160 раз сироватку крові досліджуваного хворого 3 Зрізи шкубують у вологій камері, при кімнатній температурі, на протязі однієї години 4 Після споліскування в дистильованій воді зрізи промивають в трьох порціях ЗФР по 5 хвилин 5 Зі слайд-препаратів забирають надлишки ЗФР і на зрізи наносять флуоресціюючі антитіла проти імуноглобулінів крові людини 6 Інкубацію зрізів з міченими антитілами і подальше відмивання в ЗФР проводять ВІДПОВІДНО до пп 3 і 4 7 На зрізи наносять 50мкл забуференого гліцерину (1 частина гліцерину і 3 частини ЗФР) 8 Препарати переглядають в ультрафіолетових променях під люмінесцентним мікроскопом Контрольні реакції проводять ВІДПОВІДНО ДО вищеописаної методики В негативній контрольній реакції використовують сироватку крові здорової людини, яка не містить аутоантитіл В позитивних контрольних реакціях застосовують сироватки крові хворих ПБЦ і АГ 1-го і 2-го типів, які містять аутоантитіла, які діагностуються ( ANA, SMA, AMA і LKM-антитіла) Результати імунозабарвлення тест-об'єктів сироваткою крові досліджуваного хворого оцінюють у співставленні з картинами, одержаними в контрольних імунопстохімічних реакціях, враховуючи специфічний для кожного виду аутоантитіл характер імунофлуоресценцм зрізів ANA роспізнають за однорідним ( у вигляді диску ) або крапчатим ( у вигляді мальтійського хреста ) свіченням ядер клітин SMA визначають за імунофлуоресценцією цитоплазми гладком'язевих клітин м'язевого шару синки шлунка LKM-антитіла виявляють за імунофлуоресценцією цитоплазми клітин епітелію проксимальних звивистих канальців, а АМА - пря 51131 мих канальців нефронів нирок У випадках імунозабарвлення ядер клітин і/або цитоплазми гладком'язевих клітин стінки шлунка діагностується аутоімунний гепатит 1-го типу, при імунозабарвленні цитоплазми епітеліальних клітин проксимальних звивистих канальців нефронів нирки встановлюється аутоімунний гепатит 2-го типу, а при імунозабарвленні епітеліальних клітин прямих канальців нефронів нирки розпізнається первинний біліарний цироз печінки Спосіб, який заявляється ілюструється прикладами Приклад 1 Хворий Т, 20 років Поступив в клініку інституту гастроентерології АМН України 11 12 2000 р (Історія хвороби №2774) КЛІНІЧНИЙ діагноз Хронічний активний гепатит Хронічний безкам'яний холецистит Вважає себе хворим з квітня 2000 р Скарги, загальна слабкість, стомлюваність, сонливість, тупий біль в правому і лівому підребер'ї, періодично шкірний свербіж, виділення кров'янистого характеру з носа, погане загоєння ран БІОХІМІЯ крові білок загальний - 80,0г%, альбуміни - 48відн %, глобуліни - 52відн %, білірубін загальний - 12 5ммоль/л, прямий - негат, лужна фосфатаза - 3 32ммоль/л, АЛТ - 2,6ммоль/л Маркери вірусного гепатиту не виявлені В лабораторії патоморфолопі інституту виконані імунопсгохіМІЧНІ дослідження за способом, який заявляється на закріплені на предметному склі крюстатні зрізи нирки і стінки шлунка білого лабораторного щура наносили розведену в 40 і 80 раз сироватку крові хворого, шкубували у вологій камері при кімнатній температурі на протязі одній години, потім зрізи промивали в трьох порціях ЗФР по 5 хвилин і шкубували з флуорестуючими антитілами проти імуноглобулінів крові людини у вологій камері, при кімнатній температурі на протязі однієї години Після відмивання в ЗФР на зрізи наносили розчин гліцерину, покривали предметним склом і досліджували під люмінесцентним мікроскопом ЛЮМАМ І 2 В результаті імунопстохімічного дослідження виявлені антинуклеарні антитіла і антитіла до цитоплазми гладком'язевих клітин, що дозволило діагностувати аутоімунний гепатит 1-го типу При гістологічному дослідженні бюптату печінки виявлений мікронодулярний цироз печінки На основі виконаного дослідження з урахуванням даних КЛІНІКИ і вивчення біопсії печінки у хворого встановлений заключний КЛІНІЧНИЙ діагноз Аутоімунний гепатит 1-го типу з переходом в цироз печінки Приклад 2 Хвора Р , 45 років Поступила в клініку інституту гастроентерології 14 03 2001 р (історія хвороби № 774) КЛІНІЧНИЙ діагноз Хронічний вірусний гепатит В, фаза загострення з мінімальною активністю Хворіє 12 років Скарги шкірний свербіж, періодичні кров'янисті виділення з носа БІОХІМІЯ крові, АЛТ - 1,2ммоль/л, лужна фосфатаза - 1,3ммоль/л В лабораторії патоморфолопі інституту виконані імунопстохімічні дослідження за способом, який заявляється В сироватці крові хворої виявлені печінково-ниркові антитіла, що дозволило діагностувати аутоімунний гепатит 2-го типу Приклад 3 Хвора М , 35 років Поступила в клініку інституту гастроентерології 12 03 1998 р (історія хвороби № 0685) КЛІНІЧНИЙ діагноз Хронічний активний гепатит в стадії загострення Хронічний холецистит з ГІПОТОНІЄЮ жовчного міхура Хронічний панкреатит Хронічний гастрит ерозивний в фазі загострення Вважає себе хворою на протязі року Скарги загальна слабкість, шкірний свербіж БІОХІМІЯ крові білок загальний - 86г/%, альбуміни - 46відн %, глобуліни - 54відн %, білірубін загальний - 89,3ммоль/л, прямий 58,5ммоль/л, АЛТ-2,88ммоль/л Маркери гепатиту В і С не виявлені В лабораторії патоморфолопі інституту гастроентерології виконані імунопстохімічні дослідження за способом, який заявляється В сироватці крові хворої виявлені антимітохондріальні аутоантитіла, що дозволило діагностувати первинний біліарний цироз печінки Приклад 4 Хвора Р , 50 років Поступила в клініку інституту гастроентерології 14 02 2001 р (історія хвороби № 509) КЛІНІЧНИЙ діагноз Цироз печінки з вираженою активністю в стадії декомпенсації Скарги загальна слабкість, жовтушне забарвлення шкіри і склер, втрата в вазі, здуття живота, підвищення температури, зниження діурезу, спрага, нічний кашель БІОХІМІЯ крові білок загальний 70г/%, альбуміни - 42відн %, глобуліни -58відн %, білірубін загальний - 217,8ммоль/л, прямий 149,6ммоль/л, лужна фосфатаза - 2,6ммоль/л, АЛТ - 0,72ммоль/л Маркери вірусного гепатиту не виявлені В лабораторії патоморфолопі інституту виконані Імунопстохімічні дослідження за способом, який заявляється В сироватці крові хворої виявлені антинуклеарні І антимітохондріальні антитіла, що дозволило діагностувати поєднання аутоімунного гепатиту 1-го типу і первинного біліарного цирозу печінки Спосіб діагностики аутоімунних захворювань печінки, який заявляється, використаний в умовах лабораторії патоморфолопі інституту гастроентерологи АМН України та центру імунопстохімічної діагностики при вивченні зразків сироватки крові 70 хворих з КЛІНІЧНИМИ проявами хронічного активного гепатиту Вік хворих коливався від 6 до 70 років В результаті проведених імунопстохімічних досліджень у 7 обстежених хворих (5 жінок і 2 ЧОЛОВІКІВ) був діагностований АГ 1-го типу Титр специфічних аутоантитіл ( ANA і/або SMA ) в сироватці крові хворих перевищував 1 80 Однорідне імунозабарвлення ядер клітин в слайдпрепаратах, яке свідчить про наявність в крові циркулюючих ANA, було зареєстровано в усіх спостереженнях Слід відзначити, що в одному випадку спочатку виявлялись тільки SMA Однак у подальшому, в динаміці спостереження, в сироватці крові даною хворого з'являлись ANA і аутоантитіла до парціальних клітин, що свідчило про прогресування АГ і посилення змін в імунному статусі організму АГ 2-го типу був встановлений у 4-х хворих (2 жінок І 2 ЧОЛОВІКІВ) У ВСІХ хворих в сироватці крові були виявлені LKM-антитіла, про що свідчило гранулярне імунозабарвлення цитоплазми епітеліальних клітин проксимальних звивистих канальців нефронів нирки У 3-х хворих, в яких титр LKMантитіл складав 1 40, був виявлений вірус гепагиту С, тобто відзначалось поєднання АГ 2-го типу з 51131 вірусним гепатитом С Застосування стандартної терапії (кортикостероїди, азатиопрін ) при АГ 1-го і 2-го типів мало позитивний КЛІНІЧНИЙ ефект У випадках поєднання АГ з вірусним гепатитом С імунодепресантна терапія не призначалась, ПБЦ виявлений у 2-х жінок В крові цих хворих виявлені АМА, титр яких перевищував 1 160 При постановці імунопстохімічних реакцій в слайдпрепаратах відзначалось імунозабарвлення цитоплазми епітеліальних клітин прямих канальців нефронів нирки В однієї хворої ПБЦ поєднувався з АГ 1-го типу (титр ANA вище 1 160) При гістологічному дослідженні печінки виявлялись класичні ознаки ПБЦ Таким чином, спосіб який заявляється забезпечує високу точність діагностики АГ, ПБЦ та їх поєднань Спосіб спрощує проведення імунопстохімічних досліджень, полегшує діагностику, знижує КІЛЬКІСТЬ можливих помилок в інтерпритацм одер жаних даних, особливо у випадках поєднаної циркуляції в крові АМА і LKM-антитіл, виключає необхідність отримання комерційних стандартних сироваток і коштовної комп'ютерної техніки БІБЛІОГРАФІЯ 8 1 Leuschner U Overlap syndrome Atypishe manifestationen der autoimmunehepatitis Herausgeber Dr Falk PharmaGmbH, 2001 - 61 p 2 Майер К П Гепатит и последствия гепатита Пер с нем - М Гэотар медицина, 1999 - 424 с 3 Dienstag J L , Isselbacher К J Chronic hepatitis - Harrison principle of internal medicine - 14 The edition CD-ROM 1998 4 Логинов А С , Аруин Л И Клиническая морфология печени - М Медицина, 1985 - 2 4 0 с 5 Graber R , Felber E , Раре G R et al Detection of auto antibodies against M-2, LKM and SLA in liver disease by standartized uniform ELISAtechmques//J Clm Lab A n a t - 1 9 9 4 -V 8)№ 5 - P 284292 6 C z a j a A J , Nishioka M , Morshed S A et al Pattern of nuclear immunoiluoresence and reactivities to recombmant nuclear antigen in autoimmune hepatitis//Gastroenterol-1994-V 107, № 1 - P 200-207 7 Astion M L , Hutchmson R , Ching А К et al Cytoplasm atic tutor a program for teaching interpretation of a microscope-based laboratory test //MDComput-1994-V11,№5-P 301-306 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71