Спосіб переробки тканин плаценти людини

Спосіб переробки тканин плаценти людини, що включає відмивання тканини дистильованою водою, подрібнення, екстракцію і розподіл на фракції, який відрізняється тим, що після відмивання тканину заморожують у парах рідкого азоту і подрібнюють у крюмлині, одержаний порошок крюсублімують і одержують амінокислотну та першу проміжну фракції, далі першу проміжну фракцію екстрагують при низьких температурах хладоновими розчинниками і одержують стероїдну і другу проміжну фракції, другу проміжну фракцію екстрагують фізіологічним розчином і одержують білковопептидну і третю проміжну фракції, при цьому усі фракції стерилізують швидкими електронами у дозі 8-12 кГр водою при автоклавуванні (120°С) Потім матеріал повторно автоклавують при 120°С протягом однієї години і гомогенізують до розміру часток не більше ніж 0,4мкм, після чого додають хлорид натрію до одержання ІЗОТОНІЧНОГО розчину Недоліками цього способу є також значне руйнування біологічно важливих молекулярних комплексів внаслідок подвійного автоклавування і одержання лише однієї фракції - суспензії плаценти Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб переробки плаценти [3], який включає подрібнення, екстракцію за допомогою органічних реагентів і розподіл екстракту на фракції з застосуванням хлориду натрію Екстракцію проводять 10-18 кратним об'ємом суміші хлороформу і етанолу у співвідношенні 2 1 Розподіл екстракту на фракції здійснюють шляхом введення 0,1-0,2 кратного об'єму 0,1-0,15% розчину хлориду натрію, при цьому одержують дві фракції - хлороформну і водно-етанольну 3 хлороформної фракції випаровуванням отримують ЛІПІДНИЙ комплекс, а з водно-етанольної фракції після випаровування і сушки отримують концентрат амінокислот і пептидів Недоліками цього способу є - отримання з тканини плаценти лише двох фракцій, CM 5120 - використання в якості розчинників хімічно активних речовин, які руйнують природні комплекси плаценти; - застосування хлороформу і етанолу, які є шкідливими для здоров'я людини і забруднюють навколишнє середовище при випаровуванні. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб переробки тканини плаценти людини, який би за рахунок зміни умов екстрагування забезпечив одержання максимальної кількості фракцій при збереженні природних властивостей тканини, а також виключив застосування речовин, шкідливих для здоров'я людини і забруднюючих навколишнє середовище. Ця задача вирішується тим, що в способі переробки тканини плаценти людини, який включає відмивання тканини дистильованою водою, подрібнення і екстракцію, відповідно до корисної моделі, після відмивання тканину заморожують у парах рідкого азоту і подрібнюють у кріомлині, одержаний порошок кріосублімують і одержують амінокислотну та першу проміжну фракції, далі першу проміжну фракцію екстрагують при низьких температурах хладоновими розчинниками і одержують стероїдну та другу проміжну фракції, другу проміжну фракцію екстрагують фізіологічним розчином і одержують білково-пептидну фракцію і третю проміжну, при цьому основні фракції стерилізують швидкими електронами у дозі 8-12кГр. В заявленому способі відбувається послідовне отримання: а) амінокислотної фракції (АКФ) і сухого порошку (перша проміжна фракція) після кріосублімації, б) стероїдної фракції (СФ) і другої проміжної фракції після низькотемпературної екстракції хладоновими розчинниками, в) білково-пептидної фракції (БПФ) і третьої проміжної фракції після екстракції фізіологічним розчином при температурі 35-38°С (Див. схему). Такий безвідходний технологічний процес переробки тканини плаценти дозволяє отримати максимальну кількість фракцій - 3 основні і 3 проміжні, без пошкодження молекулярних комплексів, при цьому він виключає використання хлороформу і етанолу, які є шкідливими для здоров'я людини і забруднюють навколишнє середовище при випаровуванні. АКФ конденсується на кріогенних панелях десубліматора, якщо температура останніх лежить у межах -60ч~120°С. Таку температуру легко отримати за рахунок охолодження панелей рідким азотом. В результаті, після підвищення температури у кінці процесу сушки, ми одержуємо біологічно активну водну АКФ. Як видно з таблиці 1, заявлений спосіб забезпечує більшу ніж прототип пропорційність внеску компонентів: 12 амінокислот мають більший відсотковий вміст з 17-ти амінокислот. Крім того, цінність амінокислотної фракції полягає й у значної кількості мінеральних речовин (табл.2), які одержують без пошкодження структури біохімічних та амінокислотних комплексів. Цю фракцію може бути використано у косметичній галузі, наприклад, при створенні зволожуючих масок, або у медицині, коли під час захворювання відбувається амінокислотний дисбаланс. БПФ, одержана за заявленим способом, крім амінокислот, білків і пептидів містить такі гормони, як пролактин (4100±40МЕ/л), фолікулостимулюючий гормон (50±5МЕ/л), тестостерон (11±1нмоль/л) та прогестерон (64±6нмоль/л). Тому цю фракцію можна рекомендувати для виготовлення препаратів із протизапальною, десенсибілізуючою, антиалергійною та антитоксичною дією. Завдяки заявленому способу ми отримуємо СФ зі збереженням необхідних біохімічних властивостей компонентів. За кількісним вмістом компонентів СФ має схожий склад із ліпідною фракцією, одержаною за прототипом. Вона містить ліпіди загальні (38000мг/л), жирні кислоти (9000мг/л), тригл іцириди (2500нМоль/л), холестерин (ІОООнМоль/л), але технологія нашого способу фракціонування на відміну від прототипу дозволяє зберегти і гормони: тестостерон (30±ЗнМоль/л) і прогестерон (80±8нМоль/л). Тому СФ може бути використано, у медицині як основу для виготовлення свічок і лікувальної мазі і у косметичній промисловості, наприклад, для забезпечення базального шару шкіри компонентами, необхідними для активного синтезу нових клітин. Таким чином, розроблений технологічний замкнений цикл безвідходної переробки тканини плаценти забезпечує одержання 3 основних і З проміжних фракцій, які за різною кількістю складових можуть бути використані у різних галузях. Стерилізація фракцій швидкими електронами у дозі 12-18кГр запобігає бактеріологічному забрудненню зі збереженням біологічної активності компонентів фракцій, що дає можливість використовувати фракції у промислових масштабах. Приклад Плаценту у глибокій тарі ретельно відмивають від слизу та крові у дистильованій воді, яку кілька раз змінюють. Відмиту плаценту переносять у розділочний лоток і ножицями відділяють плідні оболонки (амніотичну й хоріальну), після чого шматками Зх2см зрізають тонкий шар тканини в області котиледонів. Одержані фрагменти плаценти занурюють у ємність із дистильованою водою у співвідношенні плаценти і води (1:5) і перемішують 2-3 хвилини. Зливають надосад і доливають свіжу порцію дистильованої води, повторюючи цю процедуру кілька раз, поки надосад не буде мати блідо-рожевий колір. Відмиті фрагменти плаценти розміщують в один шар на спеціальному піддоні для швидкого заморожування у парах рідкого азоту, попередньо відрізав шматочок тканини розміром 5х5мм для тестування на вірусні інфекції (СШД, гепатит, сифіліс). Заморожені зі швидкістю охолодження не нижче 20°С/хв. до температури 60°С фрагменти плаценти зсипають у пластикові пакети і закладають у морозильну камеру, де зберігають при температурі -24°С до одержання результатів аналізів. Тільки після одержання негативних результатів тестування на вірусні інфекції проводиться подальша переробка плаценти. Для цього заморожені фрагменти плаценти, що пройшли вірусний контроль, переносять в охолоджуємий парами рідкого азоту накопичувач, і 5120 охолоджують до температури -120°С. Після цього проводять їх дрібно-дисперсне кріогенне подрібнення у ротаційно-ударному кріомлині до частинок розміром 15-ЗОмкм при температурі робочого середовища у камері подрібнення кріомлину не вище -120°С. Потім цей порошок розсипають в алюмінієві піддони шаром 12-15мм і переносять у вакуумну камеру установки для кріосублімаційного фракціонування. Температура замороженого порошку плаценти протягом перших 6-8 годин становить 20°С, а потім повільно підвищується до 10°С у кінці сушки. Процес сушки триває 12-14 годин і завершується при досягненні вологості порошку 35%. Водна фракція, що сублімується разом із фрагментами амінокислот і вітамінів, конденсується на охолоджених до температури -100-^-120°С панелях десубліматора. Після відігріву десубліматора її зливають у чисту ємність, фільтрують і розливають у скляну або пластикову тару. Одержана таким чином амінокислотна фракція являє собою прозорий водний розчин світло-жовтого кольору. Вихід продукту становить до 85% від ваги кріоподрібненого порошку плаценти. Сухий порошок витягують із вакуумної камери і зсипають у пакети з бязевої тканини, у яких його завантажують в екстрактор установки для отримання СФ за допомогою хладонових розчинників. Використовують хладон12 або хладон-22 протягом 3-5 годин при низьких температурах. Одержана в процесі екстракції стероїдна фракція являє собою легкоплавку, кремоподібну пасту коричневого кольору. її вихід становить не більш ніж 3% від ваги зануреного в екстрактор сухого порошку або до 0,35% від ваги замороженого кріоподрібненого порошку плаценти. Другу проміжну фракцію, що залишилась в екстракторі, витягують і зсипають у ємності установки для екстракції білково-пептидної фракції. Екстракцію проводять фізіологічним розчином при температурі 38-40°С протягом 3 годин, при співвідношенні другої проміжної фракції і фізіологічного розчину 1:20. Одержаний розчин рожевого кольору фільтрують і центрифугують для осадження дрібнодисперсних часток шроту, після чого додатково розбавляють фізіологічним розчином до отримання ізотоничного розчину, розливають у пластикову тару і заморожують, зберігаючи до стерилізації. При сублімаційному висушуванні білково-пептидної фракції залишається порошок світло-рожевого кольору, вага якого не перевищує 6% ваги сухого порошку або 0,6% ваги вихідного замороженого кріоподрібненого порошку плаценти. Під час проведення різних маніпуляцій з фракціями можлива їх контамінація мікроорганізмами. Щоб запобігти цьому, а також зберегти біологічну активність компонентів фракцій, усі основні фракції стерилізують швидкими електронами у дозі 12-18кГр. Джерела інформації: 1. Машковський М.Д., Лекарственные средства: Медицина. - т.2., 1994. - с. 136. 2. Пат. України №2710, А61К35/50, Публ. 26.12.94. 3. Пат. України №15241, А61К35/50, Публ. 15.09.2000. Таблиця 1 Вміст амінокислот в амінокислотній і білково-пептидних фракціях, одержаних різними способами Амінокислоти, мг % Аланін Аргінін Аспарагін Аспарагінова к-та Валін Гістидін Гліцин Глютамінова к-та Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін Пролін Серін Тирозин Треонін Фенілаланін Цистеїн Амінокислотна фракція за винаходом за прототипом 9 7,8 4,3 1,7 3 0,9 9,03 3,7 9,8 13,2 0,8 11,5 7,6 6,9 42,0 8,6 1,5 6,9 3,8 13,8 4,4 сліди 0,3 3 3,1 5,6 3,3 сліди 2,1 3,4 3,9 сліди 2,2 0,17 3,9 Білково-пептидна фракція за винаходом за прототипом 18,2 6,5 1 3,7 2,5 0,7 10,9 3,7 9,6 2,5 1,8 14,2 8,1 4,2 29,0 4,0 2,1 6,4 12,6 6,5 8,3 2,5 1,0 3,3 1,4 4,7 6,8 1,2 2,5 6,7 5,0 1,8 3,9 0,9 1,9 5120 Таблиця 2 Вміст мінеральних речовин у амінокислотній і білково-пептидних фракціях Хім ел мкМ/л АКФ Б-ПФ Мд АІ Si Р Са Сг Мп Fe Ni Си Zn Pb ЗО 400 11 100 42 600 120 5000 60 1800 0,3 8 0,2 4,2 10 180 0,2 2,8 0,3 2,0 4,5 55 0,005 0,07 Плацента АМІНОКИСЛОТНА ФРАКЦІЯ (АКФ) Прозорий водний розчин Колір am світдо-cjporo до світло-жовтого Вихід, до &5% щд, ваги £ сировини Швидке заморожування Крюздрібненнй Вірусний і бактеріологічний контроль Кріосублшащйне фракціонування Перша п р о м и т а фракцш Сухий порошок Волопсть 3-5% Колір саітло-коричневий Вихід до 12% вш ваги ВХІДНОЇ сировини СТЕРОЇДНА ФРАКЦІЯ (СФ) Кремоїюдібна, коричневого кольору, температура плавлення + 4СС Вихш до 3% ащ ваги ВХІДНОГО сухого порошку або до 0 35% в и вага вхшноі сировини Ншькотемііерат>|рна екстракція хладоновимн розчинниками протзпїм 5 годин БОІКОВО'ПШТЙДНА ФРАКЦІЯ Друга проміжна фракцш Сухий порошок рожевокоричневого кольору Волопсть до 3 % Вихід ДО 10% ВІД ваги (ЩФ) ВХІДНОЇ CHDDEHHJJ Розчии від рожевого до світлобордового кольору Висушений залишок - дарошок рожевого кольору Вихід сухого продукту 6% ВІД ваги ВХІДНОГО сухого порошку, або 0 6% від в а ш вхшноі сировини Екстракція фіііологе