Спосіб діагностики запального процесу у респіраторному тракті

Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики і може бути використаний для діагностики запального процесу у респіраторному тракті хворих з хронічними обструктивними захворюваннями легень. Хронічні обструктивні захворювання легень різного генезу поступово виходять на перше місце серед захворювань внутрішніх органів. Тому актуальність точної діагностики запального процесу у респіраторному тракті і своєчасне його лікування, є не тільки важливою медичною проблемою, але й значною соціальною проблемою, тому, що дозволить у більшості випадків запобігти появі небезпечних ускладнень. Велика імовірність виникнення ускладнень хронічних обструктивних захворювань легень, таких, як емфізема, пневмосклероз, пов'язана з неточною і несвоєчасною діагностикою запального процесу у респіраторному тракті. У зв'язку з цим, постійно ведеться пошук надійних маркерів, які дозволили б точно діагностувати розвиток запальних процесів у респіраторному тракті хворих з хронічними обструктивними захворюваннями легень. Відомий спосіб діагностики запального процесу у респіраторному тракті, що полягає у наступному: 1. Хворому проводять інгаляцію бета-агоністів(сальбутамол 200мкг, 2вдихи). 2. Вимірюють показники життєвої ємності легенів, та об'єму форсованого видиху. 3. Проводять інгаляцію 1%розчину хлориду натрію на протязі 7хвилин, з використанням ультразвукового небулайзера. 4. Намагаються отримати біологічний матеріал з респіраторного тракту - харкотиння стандартним способом. 5. При відсутності харкотиння, проводять інгаляцію послідовно 3%, 4% и 5% розчинами хлориду натрію, тривалістю по 7хвилин з кожним розчином. 6. Намагаються отримати біологічний матеріал з респіраторного тракту - харкотиння після кожної інгаляції стандартним способом, при отриманні задовільного зразка харкотиння, подальші інгаляції припиняють. 7. Визначають об'єм форсованого видиху після кожного сеансу інгаляції, при зниженні його значення більш ніж на 10%, концентрацію розчину хлориду натрію більше не підвищують, при зниженні об'єму форсованого видиху більше ніж на 20% інгаляцію припиняють. 8. Проводять гомогенізацію отриманого біологічного матеріалу з респіраторного тракту - зразка харкотиння за допомогою дитіотреітолу стандартним способом. 9. Проводять аналіз харкотиння, з визначенням кількості клітин у харкотинні стандартним способом. 10. Діагностують наявність запального процесу у респіраторному тракті при кількості клітин, яка перевивищує більш, ніж на 10% кількість клітин у харкотинні практично здорових осіб, отриманого при тих самих умовах [Авдеев С. Η., Анаев Э. X., Чучалин А. Г. Применение метода индуцированной мокроты для оценки интенсивности воспаления дыхательных путей.// Пульмонология., 1998, №2. С. 81 - 87.] Суттєвими ознаками аналогу і винаходу, що збігаються є такі: 1. Отримання біологічного матеріалу з респіраторного тракту. Не зменшуючи значення вказаного способу діагностики запального процесу у респіраторному тракті, слід вказати, що отримання необхідного зразка харкотиння - досить суб'єктивний етап виконання даного способу діагностики запального процесу у респіраторному тракті. Присутність суб'єктивізму негативно впливає на відтворюваність отримуваних результатів. Процедура отримання зразка індукованого харкотиння, спричиняє суттєвий вплив на слизову оболонку респіраторного тракту, змінюючи її біологічні умови функціонування, крім того включає багато операцій та є надто тривалою(близько 30хвилин). Це значно зменшує точність та відтворюваність даного способу діагностики запального процесу у респіраторному тракті. Клітинний склад отриманого таким чином індукованого харкотиння може відображати не патологічні зміни у респіраторному тракті, пов'язані з запальним процесом, а реакцію респіраторного тракту на інгаляцію гіпертонічного розчину хлориду натрію. Наведені факти не дозволяють віднести вказаний спосіб діагностики запального процесу у респіраторному тракті до розряду достатньо точних, достовірних та відтворюваних. Найбільш близьким за технічною суттєвістю та досягаємим результатом є спосіб діагностики запального процесу у респіраторному тракті, що полягає у наступному: 1. Отримують біологічний матеріал з респіраторного тракту - видихаєме повітря, розчинене у слині, стандартним способом. 2. Аналіз слини проводять не пізніше 3 - 5хвилин після отримання. 3. Слину фільтрують через ватний тампон. 4. До зразка слини об'ємом 50мкл у мікрокюветі додають 50мкл реактиву Griess. 5. Інкубують 10хвилин при 22°С. 6. Реєструють оптичну щільність реакційної суміші при 540нм, за допомогою фотоелектроколориметричного рідера. 7. Визначають вміст нітрит-іону по калібровочній кривій стандартним способом. 8. Діагностують запальний процес у респіраторному тракті при рівні нітрит-іонів, більшому, ніж той, що встановлений у практично здорових осіб [Назаретян Э. Е., Нариманян М. 3., Мартиросян Т. В., Гаспарян А. Ю. Содержание окиси азота в слюне и легочная гипертензия у больных с различной степенью тяжести бронхиальной астмы.// Пульмонология. 2000, №2. С. 23 - 27.] Спільними суттєвими ознаками прототипу і способу, що заявляється є: 1. Отримання біологічного матеріалу з респіраторного тракту. 2. Додавання до реакційної суміші реактиву Griess. 3. Реєстрація оптичної щільності реакційної суміші при 540нм за допомогою фотоелектроколориметричного рідера. 4. Визначення вмісту нітрит-іонів. Беручи до уваги неінвазивність, безпечність для здоров'я обстежуваного та простоту виконання даного способу діагностики запального процесу у респіраторному тракті, він вимагає деяких принципових зауважень. Використання слини, як джерела розчиненого видихаємого повітря в якості матеріалу для дослідження рівня нітрит-іонів, не дає змоги отримувати достатньо достовірні результати, через неможливість стандартизації процедури отримання слини для кількісного аналізу, та наявність різноманітних чинників, які спроможні впливати на розчинність видихаємого повітря в слині. До того ж рівень нітрит-іонів у слині значною мірою залежить від стану слизової оболонки порожнини рота, а також від надходження оксиду азоту та його метаболітів їз назальних порожнин. У вказаному способі відсутній етап конверсії нітрат-іонів слини у нітрит-іони, що значно погіршує точність діагностики запального процесу у респіраторному тракті, бо відомо, що рівень продукції оксиду азоту в організмі прямо пропорційний вмісту кінцевих метаболітів його: нітрит- та нітрат-іонів. Відсутність етапу депротеінізації зразка слини також негативно відображається на точності та достовірності діагностики запального процесу у респіраторному тракті через те, що продукти білкового метаболізму спроможні впливати на оптичну щільність реакційної суміші, яка реєструється при 540нм. В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу діагностики запального процесу у респіраторному тракті, шляхом застосування іншого біологічного матеріалу, проведення додаткових етапів лабораторного дослідження, що дозволить підвищити точність, достовірність та відтворюваність результатів дослідження. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі діагностики запального процесу у респіраторному тракті шляхом отримання біологічного матеріалу з респіраторного тракту, додавання до реакційної суміші реактиву Griess, реєстрації оптичної щільності реакційної суміші при 540нм, за допомогою фотоелектроколориметричного рідера, та визначення вмісту нітрит-іонів, новим є те, що в якості біологічного матеріалу з респіраторного тракту використовують конденсат видихаємого повітря, який отримують шляхом видихання повітря на поверхню охолодженої чашки Петрі, депротеїнізують конденсат видихаємого повітря розчинами сульфату цинку і гідроксиду натрію, конвертують нітрат-іони у нітрит-іони за допомогою металевого кадмію та діагностують запальний процес у респіраторному тракті при вмісті нітрит-іонів більш, ніж 1,79мкМ. Причинно - наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом, що досягається полягає у наступному: для діагностики запального процесу у респіраторному тракті визначають вміст кінцевих метаболітів оксиду азоту: нітрит- і нітрат-іонів, у конденсаті видихаємого повітря. Відомо, що рівень вказаних кінцевих метаболітів оксиду азоту в організмі прямо пропорційний продукції оксиду азоту, який у великій кількості продукується клітинами неспецифічного захисту при запальних процесах. В умовах запального процесу у респіраторному тракті, значна генерація оксиду азоту притаманна насамперед епітеліальним клітинам, які є найбільш чутливими в цих умовах. Значне збільшення продукції оксиду азоту пов'язане з експресією індуцибельної ізоформи синтази оксиду азоту. Індукторами експресії даної ізоформи синтази оксиду азоту в клітинах неспецифічного захисту є бактеріальні ліпополісахариди і цитокіни: інтерлейкін-1, гама-інтерферон, фактор некрозу пухлин-альфа, рівень яких значно збільшується в умовах розвитку запалення. Оксид азоту є важливим внутрішньо- і міжклітинним посередником здійснення багатьох життєво важливих функцій в організмі, серед яких регуляція функціонального стану епітелію і гладенько - м'язових клітин респіраторного тракту, шляхом модуляції активності гуанілатциклази, потужна мікробіцидна активність та здатність регулювати функціонально - метаболічний стан клітин неспецифічного захисту, що має суттєве значення при розвитку запального процесу у респіраторному тракті. Неповний перелік проявів функціональної активності оксиду азоту, вказує на значну актуальність визначення його рівня у конденсаті видихаємого повітря, для діагностики запального процесу у респіраторному тракті. Відомо, що конденсат видихаємого повітря, крім розчинених летючих сполук, містить також ряд білкових, які можуть зменшити відновлювальну здатність гранул металічного кадмію. Тому процедура проведення депротеїнізації конденсату видихаємого повітря, є важливим етапом при визначенні рівня кінцевих метаболітів оксиду азоту в організмі, а отже і діагностики запального процесу у респіраторному тракті. Так само важливим етапом є конверсія нітрат-іонів у нітритіони. Визначення лише рівня нітрит-іонів не дає змоги точно і достовірно оцінити продукцію оксиду азоту в організмі людини, через те, що значна частина нітрит-іонів окислюється далі до нітрат-іонів. У зв'язку з цим необхідно проводити конверсію нітрат-іонів до нітрит-іонів за допомогою гранул металевого кадмію, з метою підвищення точності, достовірності та відтворюваності результатів дослідження. Таким чином, дослідження рівня продукції оксиду азоту за вмістом кінцевих метаболітів його у конденсаті видихаємого повітря, з обов'язковим проведенням додаткових етапів лабораторного дослідження: депротеїнізації досліджуваного зразка та конверсії нітрат-іонів до нітрит-іонів у ньому, дозволить значно підвищити точність, достовірність та відтворюваність способу діагностики запального процесу у респіраторному тракті. Для визначення показника норми, нами було обстежено 35 практично здорових осіб. Серед обстежених були представлені різні вікові групи(згідно рекомендацій ВОЗ), середній вік склав 32,2 ± 12,6 роки, жінок було 12(34,3%), чоловіків 23(65,7%). Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб, вміст нітрит-іонів в конденсаті видихаємого повітря склав 1,780 ± 0,008мкМ. Спосіб здійснюється таким чином: 1. Отримують біологічний матеріал з респіраторного тракту - конденсат видихаємого повітря, шляхом видихання повітря на поверхню охолодженої чашки Петрі впродовж 5хвилин з середньою частотою(16 – 18 за хвилину). При цьому вдихання і видихання повітря здійснюється через рот. 2. Проводять депротеїнізацію конденсату видихаємого повітря, для чого змішують 50мкл отриманого конденсату видихаємого повітря з розчином сульфату цинку(кінцева концентрація - 0,4%) та гідроксиду натрію(кінцева концентрація - 27,5мМ). 3. Реакційну суміш ретельно перемішують. 4. Центрифугують 20хвилин при 800g(радіус від вісі центрифуги до середини розділяємої рідини: К = 15см). 5. Відбирають депротеїнізовану надосадову рідину для подальшого аналізу. 6. До 0,25г гранул металевого кадмію додають 0,5мл сірчаної кислоти. 7. Гранули ретельно суспендують. 8. Центрифугують 1хвилину при 400g(радіус від вісі центрифуги до середини розділяємої рідини: К = 15см) 9. Надосадову рідину відбирають. 10. До осаду гранул кадмію додають дистильованої води і відмивають гранули шляхом центрифугування протягом 1хвилини при 400g(радіус від вісі центрифуги до середини розділяємої рідини: К = 15см) 11. Процедуру відмивання гранул кадмію проводять тричі дистильованою водою і один раз 0,2М гліцин-гідроксид натрію буферним розчином(рН - 9,7). 12. Після останнього відмивання, надосадову рідину повністю відбирають. 13. Конвертують нітрат-іони у нітрит-іони, для чого до гранул кадмію додають депротеїнізовану досліджувану пробу. 14. Додають 80мкл 0,6М гліцин-гідроксид натрію буферного розчину(рН - 9,7). 15. Інкубують реакційну суміш 20хвилин при кімнатній температурі(22°С). 16. Центрифугують реакційну суміш 1хвилину при 400g(радіус від вісі центрифуги до середини розділяємоЇ рідини: R = 15cм) 17. До надосадової рідини об'ємом 200мкл, додають реактив Griess у співвідношенні 2 : 1. 18. Інкубують суміш 15хвилин при кімнатній температурі(22°С). 19. Реєструють оптичну щільність інкубаційної суміші при 540нм, за допомогою фотоелектроколориметричного рідера. 20. Визначають вміст нітрит-іону по калібровочній кривій стандартним способом. 21. Діагностують запальний процес у респіраторному тракті при рівні нітрит-іонів, більшому, ніж 1,79мкМ. Приклад: Хвора В. 35років надійшла у пульмонологічне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні зі скаргами на слабкість, спітнілість, головний біль, періодичне утруднене дихання експіраторного характеру переважно у нічні години, задуху у спокої та при найменшому фізичному навантаженні, сухий кашель. Вказані ознаки порушення функції дихання зникали ненадовго після інгаляції "Сальбутамолу"(2 вдихи). Вважає себе хворою на протязі 3років, коли після переохолодження, на тлі фебрильної температури з'явився кашель з харкотинням, задуха, що виникала при незначному фізичному навантаженні. Згодом хвора знаходилась на стаціонарному лікуванні з приводу хронічного бронхіту, одержувала антибактеріальну, протизапальну та бронхолітичну терапію. За три дні до надходження в клініку, після перенесеної гострої респіраторної вірусної інфекції, з'явилися вищезазначені скарги, виникнення яких хвора пов'язує з пранням порошком певної марки та хвора була госпіталізована для лікування загострення захворювання. Анамнез життя - без особливостей, спадкової патології в родині не виявлено. Пацієнтка не палить, інші шкідливі звички заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений. Об'єктивно спостерігаються наступні зміни. При огляді відзначається участь допоміжних м'язів в акті дихання. При пальпації голосове тремтіння дещо послаблене, верхівковий поштовх визначається нечітко. Перкуторно - над всією поверхнею легеневих сухі свистячі хрипи з коробковим відтінком, зліва мілкопузирчасті вологі хрипи, аускультативно - діяльність серця правильна, тони приглушені, в легенях дихання жорстке, велика кількість розсіяних сухих та вологих хрипів, більше у нижніх відділах. Частота дихання 26 за 1хвилину, дихання поверхневе. Артеріальний тиск у момент надходження 140/90мм. рт. ст., пульс 78ударів за хвилину, задовільних властивостей. На електрокардіограмі - ознаки гіпертрофії міокарду правого шлуночка, порушення процесів реполяризації в правих грудних відведеннях, неповна блокада правої ніжки пучка Гіса. При ехокардіографічному дослідженні спостерігається збільшення порожнини правого шлуночка, потовщення передньої стінки правого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, парадоксальний рух міжшлуночкової перетинки у сістолу, помірне зниження скоротливих властивостей лівого шлуночка. При рентгенологічному дослідженні: легені без видимих очагово - інвільтративних змін, з посиленим судинним малюнком, корені структурні. Під час знаходження у стаціонарі, після зміни постільної білизни з'явилось утруднене дихання, задуха, підвищився артеріальний тиск до 210/100мм. рт. ст. Вказаних явищ вдалося позбутися інгаляцією "Сальбутамолу"(200мкг 2вдохи) та інтравенозним введенням розчину еуфіліну. Пізніше виявилось, що для прання білизни використовували порошок тої ж самої марки, на який у хворої відмічались приступи задухи і утрудненого дихання. Враховуючи скарги хворої, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження, виникла необхідність додаткових лабораторних досліджень з метою діагностики імовірного запального процесу у респіраторному тракті. Для цього було проведено дослідження індукованого харкотиння, після інгаляції 3% розчину хлориду натрію з використанням ультразвукового небулайзера, був отриманий зразок слизистого харкотиння, об'ємом 2мл. Аналіз харкотиння виявив у полі зору незначну кількість клітин плоского епітелію, 1 - 2клітини циліндричного епітелію, 7 - 10лейкоцитів, поодинокі скупчення альвеолярних макрофагів, поодинокі еозинофіли. Отримані результати аналізу індукованого харкотиння відповідали показникам практично здорових осіб і не дозволили діагностувати запальний процес у респіраторному тракті. Але враховуючи дані анамнезу та клінічної картини захворювання, імовірність існування запального процесу була досить великою, тому для діагностики запального процесу у респіраторному тракті був застосований пропонуємий спосіб. Після обчислення отриманих результатів вміст нітрит-іонів склав 11,7мкМ, що значно перевищувало діагностичний рівень. Це дозволило діагностувати запальний процес у респіраторному тракті і точно встановити діагноз: бронхіальна астма, легка персистуюча течія, загострення та призначити курс патогенетично обумовленої терапії. Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволило точно діагностувати запальний процес у респіраторному тракті, вчасно призначити необхідну терапію і відвернути появу ускладнень.