Спосіб виявлення рнк ентеровірусів свиней а методом зворотнотранскриптазної полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб виявлення РНК ентеровірусів свиней А методом зворотнотранскриптазної полімеразної 3 51551 4 Таблиця Температурні і часові параметри ампліфікації специфічної ділянки кДНК ентеровірусів свиней А № циклу 1 Температура 95°С 94°С 2 Час 5хв. 1хв. 1хв. 58°С Кількість циклів 1 5 1хв. 74°С 94°С 3 0,5хв. 0,5хв. 58°С 35 0,5хв. 4 5 73°С 72°С 5хв. Зберігання У результаті отримують продукт ампліфікації розміром 458 нуклеотидних пар. Після закінчення ампліфікації проби досліджують стандартним методом електрофорезу в агарозному гелі. Проведено дослідження 16 зразків, з яких: 12 - матеріал, інфікований штамами тешо-, ентеровірусів свиней, 2 - штамами коронавірусу, 2 - суспензії культур клітин СНЕВ та ВНК-21. У 5 зразках виявлено РНК ентеровірусів свиней А. Отже, розроблено спосіб виявлення РНК ентеровірусів свиней А на основі ЗТ ПЛР з використанням оригінальних штучно синтезованих олигонуклеотидних праймерів. Приклад. Пробу інфікованого матеріалу об'ємом 100мкл вносимо у пластикову пробірку ємністю 1,5см3 після чого виділяємо РНК набором реагентів для виділення РНК. У результаті отримуємо зразок рибонуклеїнової кислоти для постановки реакції зворотної транскрипції. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК використовуємо для наступної постановки полімеразної ланцюгової реакції. Отриману кДНК (10мкл) поміщуємо у пробірку ємністю 0,5см3 і додаємо 15мкл ПЛР-буфера, 2,5мкл dNTP, по 2,5мкл праймерів, 0,25мкл Tag Комп’ютерна верстка А. Крулевський 1 полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшуємо і центрифугуємо, а потім поміщуємо в ампліфікатор "Терцик", якому задаємо вищевказану програму. Детекцію продуктів реакції проводили за допомогою електрофорезу у 1,5% агарозному гелі (забарвленому бромідом етидію) з використанням трис-боратного буфера при градієнті напруги 10В/см. Результати оцінювали при перегляді гелю після електрофорезу на трансілюмінаторі під УФсвітлом по наявності (або відсутності) червонопомаранчевих фрагментів ДНК розміром 458 нуклеотидних пар. Наявність описаного фрагменту доводить присутність РНК ентеровірусів свиней А у досліджуваному зразку. Література: 1. Рекомендації з діагностики, профілактики та ліквідації тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней / Сорока В.І., Бокун А.О., Дерев'янко С.В. та інш. - Чернігів: ЦНТЕІ, 2006. - 28 с. 2. Detection of porcine enteroviruses by nRTPCR: differetion of CPE groups I-III specific primer sets / Zell R., Krumbholz A., Henke A. et al. // J. Virol. Methods. - 2000. - Vol. 88, № 2. - P. 205-218. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601