Спосіб визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів

Спосіб визначення функціональної активності Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики і може бути використаний для визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів при захворюваннях внутрішніх органів Уява про роль еозинофільних лейкоцитів у патогенетичних механізмах розвитку алергічних захворювань поступово змінилась від ефекторних клітин, що ІНІЦІЮЮТЬ розвиток запалення і спричиняють суто руйнівний вплив на тканини шокового органа, до ефекторних клітин з регуляторною дією на розвиток запальних процесів Відомо, що не завжди протікання алергічних захворювань супроводжується розвитком еозинофіли за даними аналізу їх КІЛЬКОСТІ у периферичній крові У зв'язку з цим визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів при захворюваннях внутрішніх органів, а особливо при алергічних захворюваннях та паразитарних інфекціях дає важливу інформацію про перебіг та напрямок розвитку запальних реакцій Відомий спосіб визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів, що полягає у наступному 1 Отримують кров, стабілізовану гепарином стандартним способом 2 Кров шкубують ЗО хвилин при37°С для отримання суспензії лейкоцитів у плазмі крові 3 Відстояну суспензію лейкоцитів центрифугують 20 хвилин при 1500об/хвилину 4 Надосадову рідину видаляють еозинофільних лейкоцитів, що полягає у проведенні лабораторного дослідження, отриманні стабілізованої гепарином крові і ОЦІНЦІ здатності еозинофільних лейкоцитів зв'язуватися з біологічними об'єктами, який відрізняється тим, що як біологічні об'єкти використовують бактеріальні клітини добової живої культури Staphylococcus epidermidis та визначають функціональну активність еозинофільних лейкоцитів за КІЛЬКІСТЮ фагоцитованих бактерій у перерахунку на 100 еозинофільних лейкоцитів 5 Осад лейкоцитів ресуспендують у живильному середовищі "199" 6 Суспензію лейкоцитів нашаровують на ступінчастий градієнт ЩІЛЬНОСТІ, ЩІЛЬНІСТЮ 1,092 і 1,115г/см3 7 Виділяють різні за ЩІЛЬНІСТЮ популяції еозинофільних лейкоцитів на вказаних градієнтах стандартним способом 8 Визначають КІЛЬКІСТЬ еозинофільних лейкоцитів у суспензіях клітин з ЩІЛЬНІСТЮ менше за 1,115г/см і у суспензіях з ЩІЛЬНІСТТЮ більшою за 1,115г/см3 9 Розраховують співвідношення КІЛЬКОСТІ еозинофільних лейкоцитів низької ЩІЛЬНОСТІ (ЩІЛЬНІСТЬ менше 1,115 г/смЗ) до КІЛЬКОСТІ еозинофілів високої ЩІЛЬНОСТІ (ЩІЛЬНІСТЬ вище 1,115г/см3) 10 Визначають функціональну активність еозинофільних лейкоцитів по співвідношенню вказаних популяцій еозинофільних лейкоцитів (Берестецкий А Б , Лещенко И В , Кардашина И А Изменение свойств эозинофилов под влиянием сыворотки больных бронхиальной астмой// Пульмонология -1997 -№2 - С 57-60) Суттєвими ознаками аналогу І винаходу, що збігаються є такі 1 Проведення лабораторного дослідження 2 Отримання стабілізованої гепарином крові Не зменшуючи значення вказаного способу для оцінки функціональної активності еозинофільних лейкоцитів, слід зауважити, що зазначена процедура виділення еозинофільних лейкоцитів є СО Ю 52123 надто тривалою І багатоетапною Це в значній мірі може змінити функціональний стан клітин і негативно позначитись на достовірності і відтворюваності визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів Звертає на себе увагу те, що оцінюваний фізичний показник еозинофільних лейкоцитів - їх ЩІЛЬНІСТЬ, дозволяє визначити лише наявність функціонально активованих еозинофільних лейкоцитів і не дає Інформації про ступінь їх загальної функціональної активності Тому, характеристика лише якісних змін функціональної активності еозинофільних лейкоцитів, яка визначається у вказаному способі, не дає змоги достатньо точно визначити їх функціональний стан Найбільш близьким за технічною суттєвістю та досягаємим результатом є спосіб визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів, що полягає у наступному 1 Отримують кров, стабілізовану гепарином стандартним способом 2 Кров шкубують ЗО хвилин при 37°С, для отримання суспензії лейкоцитів у плазмі крові 3 Відстояну суспензію лейкоцитів центрифугують 20 хвилин при 1500об/хвилину 4 Надосадову рідину видаляють 5 Осад лейкоцитів ресуспендують у живильному середовищі "199" 6 Суспензію лейкоцитів нашаровіють на ступінчастий градієнт, ЩІЛЬНІСТЮ 1,092 І 1,115г/см3 7 Виділяють популяцію еозинофільних лейкоцитів низької ЩІЛЬНОСТІ з ЩІЛЬНІСТЮ меншою за 1,115г/см3 стандартним способом 8 Суспензію еозинофільних лейкоцитів об'ємом 0,1мл змішують з 0,1мл 0,5% суспензії біологічних об'єктів - еритроцитів барана 9 Центрифугують суспензію 3 хвилини при ЮООоб/хвилину 10 Інкубують суспензію 15 хвилин при кімнатній температурі 11 Додають до суспензії 0,1 мл 3% розчину глютарового альдегіду та інкубують 5 хвилин при кімнатній температурі 12 Обережно ресуспендують клітини з осаду і додають 1мл фізіологічного розчину 13 Центрифугують суспензію, надосадову рідину зливають 14 Із осаду готують мазок на предметному склі стандартним способом 15 Мазок фіксують і фарбують стандартним способом 16 У світовому мікроскопі, під імерсією оцінюють здатність еозинофільних лейкоцитів зв'язуватись з біологічними об'єктами шляхом підрахування "розеток", що утворились між еозинофільними лейкоцитами низької ЩІЛЬНОСТІ та трьома і більше біологічними об'єктами - еритроцитами барана 17 Визначають функціональну активність еозинофільних лейкоцитів при ВІДНОСНІЙ КІЛЬКОСТІ розеткоутворюючих еозинофільних лейкоцитів низької ЩІЛЬНОСТІ (Берестецкий А Б , Лещенко И В, Бельтюков Е К и др Различия свойств эозинофилов крови у больных бронхиальной астмой, атоническим дерматитом и описторхозом // Пульмонология -1997 -№8 - С 34-42 ) Суттєвими ознаками прототипу і винаходу, що збігаються, є такі 1 Проведення лабораторного дослідження 2 Отримання стабілізованої гепарином крові 3 Оцінка здатності еозинофільних лейкоцитів зв'язуватись з біологічними об'єктами Наведений вище спосіб визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів грунтується на ОЦІНЦІ стану рецепторного апарату їх цитоплазматичної мембрани Оцінка стану рецепторного апарату є більш природнім для визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів порівняно з оцінкою фізичних властивостей цих клітин Однак, враховуючи практичне значення вказаного способу, слід зробити деякі зауваження Надто тривала процедура виділення еозинофілів низької ЩІЛЬНОСТІ у даному способі може позначитись як на КІЛЬКОСТІ еозинофілів низької ЩІЛЬНОСТІ, так і на стані їх рецепторного апарату, що загалом негативно впливає на точність і відтворюваність визначення функціональної активності цих клітин До того ж, у процедурі виділення клітин на градієнті ЩІЛЬНОСТІ відсутній етап визначення їх життєздатності, який є необхідним для отримання точних і достовірних результатів Додавання глютарового альдегіду до осаду клітин приводить до неспецифічного "зшивання" еозинофільних лейкоцитів низької ЩІЛЬНОСТІ з еритроцитами барана і, як наслідок - отримання хибнозавищених результатів дослідження Таким чином, вказаний спосіб дозволяє визначити лише відносну КІЛЬКІСТЬ активованих еозинофільних лейкоцитів і не дає загальної характеристики ступеня їх функціональної активності Наведені зауваження значно зменшують точність та відтворюваність результатів дослідження і ВІДПОВІДНО - і достовірність визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів шляхом застосування інших біологічних об'єктів і зміни методики оцінки результатів дослідження, що дозволить ПІДВИЩІТИ точність, достовірність і відтворюваність результатів дослідження Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів шляхом проведення лабораторного дослідження, отримання стабілізованої гепарином крові і оцінки здатності еозинофільних лейкоцитів зв'язуватися з біологічними об'єктами, новим є те, що в якості біологічних об'єктів використовують бактеріальні клітини добової живої культури Staphylococcus epidermidis та визначають функціональну активність еозинофільних лейкоцитів за КІЛЬКІСТЮ фагоцитованих бактерій у перерахунку на 100 еозинофільних лейкоцитів Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у наступному у фізіологічних умовах еозинофільні лейкоцити практично не здатні до фагоцитарної активності Здатність до фагоцитозу бактерій з'являється у цих клітин в умовах зростання їх функціональної активності Передумовою до цього є значне підвищення експресії різних за специфічністю молекул адгезії на цитоплазматич 52123 ній мембрані еозинофільних лейкоцитів Це призводить до появи не характерної для цих клітин у фізіологічних умовах властивості - здатності до фагоцитозу, тоді, як неспецифічні рецептори для еритроцитів барана експресуються на мембрані еозинофільних лейкоцитів і в фізіологічних умовах Використання запропонованої нами властивості активованих еозинофільних лейкоцитів - здатності до фагоцитозу, дозволяє значно збільшити точність і достовірність визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів До того ж використання фагоцитарних показників дозволяє, без застосування травматичної для клітин, нефізіолопчної процедури їх виділення, оцінити також інтенсивність функціональної активності еозинофільних лейкоцитів, що значно підвищує точність та відтворюваність визначення функціональної активності еозинофільних лейкоцитів Таким чином, визначення фагоцитарної активності показників, дозволяє визначити функціональну активність еозинофільних лейкоцитів з високим ступенем точності, достовірності і відтворюваності результатів лабораторного дослідження Для визначення показника норми нами було обстежено 26 практично здорових осіб -дітей, віком від 5 до 15 років Середній вік склав 8,9+1,3 років, дівчат було 15 (57,7%), хлопчиків - 11 (42,3%) Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб, було встановлено, що еозинофільні лейкоцити практично не проявляли фагоцитарної активності, яка становила 0-1% Після обстеження 42 дітей, хворих на бронхіальну астму встановлено, що у 34 хворих з легким і середнім ступенем тяжкості, КІЛЬКІСТЬ функціонально активних еозинофільних лейкоцитів становила в середньому 4,2%, при цьому у 73,5% цих хворих виявилось 0,08-0,8 фагоцитованих бактерій у перерахунку на 100 еозинофільних лейкоцитів, що вказувало на незначну інтенсивність функціональної активності еозинофільних лейкоцитів, у 8 хворих з середньо-важким перебігом хвороби КІЛЬКІСТЬ функціонально активних еозинофільних лейкоцитів склала в середньому 12,3%, при цьому у 75,0% цих хворих виявилось більше ніж 0,8 фагоцитованих бактерій у перерахунку на 100 еозинофільних лейкоцитів, що вказувало на високу інтенсивність функціональної активності еозинофільних лейкоцитів Спосіб здійснюється таким чином 1 Отримують стабілізовану гепарином кров стандартним способом 2 Центрифугують 5 хвилин при ЮООоб/хвилину 3 Відбирають 0,2мл суспензії клітин з верхнього шару осаду клітинних елементів крові 4 Підраховують абсолютну КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів у суспензії 5 Із добової культури Staphylococcus epidermidis готують суспензію бактеріальних клітин з КІЛЬКІСТЮ у 10 разів більшу за КІЛЬКІСТЬ лейкоцитів 6 0,1мл суспензії лейкоцитів змішують з 0,1мл суспензії бактеріальних клітин 7 Інкубують суспензію ЗО хвилин при 37°С,періодично перемішуючи 8 Із частини суспензії готують тонкий мазок стандартним способом 9 Мазок фіксують і фарбують стандартним способом 10 У світовому мікроскопі, під імерсією оцінюють здатність еозинофільних лейкоцитів зв'язуватись з біологічними об'єктами, шляхом підрахування відносної КІЛЬКОСТІ еозинофільних лейкоцитів, що містять фагоцитовані бактерії із 100 нарахованих еозинофільних лейкоцитів 11 Визначають середню КІЛЬКІСТЬ бактерій, що були фагоцитовані у перерахунку на 100 нарахованих еозинофільних лейкоцитів 12 Визначають функціональну активність еозинофільних лейкоцитів за кількостю фагоцитованих бактерій у перерахунку на 100 еозинофільних лейкоцитів Приклад Хворій С 8 років надійшов у алергологічне відділення 5-і міської дитячої клінічної лікарні зі скаргами на слабкість, СПІТНІЛІСТЬ, головний біль, утруднене дихання, кашель з відходженням незначної КІЛЬКОСТІ харкотиння Хворіє з 5 років, коли під час ЛІТНІХ канікул з'явився приступ задухи, що виник після контакту з собакою, що супроводжувався кашлем Приступ був знятий після застосування інгаляційних бета2-агоністів та внутрішньовенного введення еуфіліну Згодом хворий тричі знаходився на стаціонарному лікуванні з приводу бронхіальної астми, одержував курси профілактичного лікування За три дні до надходження в клініку, з'явились вищезазначені скарги, які батьки хворого асоціювали з ЦВІТІННЯМ амброзії, що не знімались звичайними засобами і хворий був госпіталізований у алергологічне відділення Анамнез життя - вапдність та пологи у матері протікали без особливостей, в період раннього дитинства розвиток нормальний, відмічають часті (ДВІЧІ, тричі на рік) респіраторні інфекції Алергологічний анамнез обтяжений - мати хворого страждає на бронхіальну астму Об'єктивно спостерігаються такі зміни При огляді відзначається блідість шкіряних покровів, відмічається залученість допоміжних м'язів В акті дихання, часте дихання (ЗО за хвилину) Перкуторно - над всією поверхнею легенів звук з коробковим ВІДТІНКОМ, відмічається зміщення нижнього краю легенів вниз та обмеження його екскурси, аускультативно ДІЯЛЬНІСТЬ серця правильна, тони приглушені, в легенях дихання послаблене, велика КІЛЬКІСТЬ розсіяних сухих хрипів Артеріальний тиск у момент надходження в клініку 90 і 60мм рт ст, пульс 112 ударів за хвилину, задовільних властивостей На електрокардіограмі - патологічних змін не виявлено При спірометричному дослідженні відзначається зниження об'єму форсованого видиху та індексу Тіффно до 65% При пікфлоуметрм відмічається зниження швидкості пікового видиху до 72% і збільшення різниці між вранішніми та вечірніми показниками до 28% При рентгенологічному дослідженні збільшення повітряності легеневих полів При лабораторному дослідженні - харкотиння слизисте, лейкоцити на одну третину поля зору переважно за рахунок еозинофілів, виявлені кристали Шарко-Лейдена Дані формули крові паличкоядерні нейтрофіли - 5%, сегментоядерні лейкоцити 45%, еозинофільні лейкоцити - 4%, базофільні лейкоцити - 0%, моноцити - 1 1 % , лімфоцити - 35% 52123 Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження та зважаючи на результати додаткових методів дослідження, хворому був поставлений КЛІНІЧНИЙ діагноз - Бронхіальна астма персистуюча, середньої тяжкості, загострення Для визначення встановлення внеску еозинофільних лейкоцитів у розвиток патологічного стану, була визначена їх функціональна активність за КІЛЬКІСТЮ "розеткоутворюючих" еозинофілів низької ЩІЛЬНОСТІ, яка склала у хворого 3% Цей показник вказував на незначну функціональну активність еозинофільних лейкоцитів, що не відповідало КЛІНІЧНІЙ картині захворювання Тому було проведено визначення функціо 8 нальної активності еозинофільних лейкоцитів запропонованим нами способом Після обчислення результатів дослідження фагоцитарної активності еозинофільних лейкоцитів, КІЛЬКІСТЬ фагоцитованих бактерій становила 1,4 на 100 еозинофільних лейкоцитів, що вказувало на значну інтенсивність функціональної активності еозинофільних лейкоцитів і відповідало стану хворого Таким чином, використання способу, що пропонується, дало можливість отримувати в значній мірі точні і відтворювані результати досліджень, а також дозволило з високим ступенем точності та достовірності визначити функціональну активність еозинофільних лейкоцитів ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71