Спосіб оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях

Спосіб оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, що полягає у отриманні зразка видихуваного повітря, додаванні до реакційної суміші реактиву Gness, реєстрації оптичної ЩІЛЬНОСТІ реакційної суміші при 540 нм за допомогою фотоелектроколориметричного рідера та визначенні вмісту нітрит-юнів, який відрізняється тим, що отримують зразок видихуваного повітря шляхом видихання його на поверхню охолодженої чашки Петрі, депротеїнізують конденсат видихуваного повітря розчинами сульфату цинку і гідроксиду натрію, конвертують нітрат-юни у нітрит-юни за допомогою металевого кадмію та оцінюють інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях при ВМІСТІ нітрит-юнів в межах 2,23 - 4,56 мкМ - як незначну, в межах 4,57 -10,12 мкМ - як середню, в межах від 10,13 мкМ - як високу Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики і може бути використаний для оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях у хворих з хронічними обструктивними захворюваннями легень Бронхолегеневі захворювання займають одне з перших місць серед захворювань внутрішніх органів населення України Тому важливою медичною проблемою є розробка точних способів оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, що дозволить своєчасно провести необхідну терапію та у більшості випадків запобігти появі небезпечних ускладнень Велика імовірність виникнення ускладнень бронхолегеневих захворювань, пов'язана з неточною та несвоєчасною оцінкою інтенсивності запального процесу при них, що в підсумку приводить до росту інвалідизацм та смертності серед населення У зв'язку з цим, ведеться активний пошук надійних маркерів, які дозволили б оцінювати інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях у хворих з хронічними обструктивними захворюваннями легень торного тракту - бюптат слизової оболонки бронха стандартним способом 2 Готують парафінові зрізи бюптату слизової оболонки бронха стандартним способом 3 Фарбують зрізи бюптату гематоксилінеозином стандартним способом Відомий спосіб оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, що полягає у наступному 1 Отримують біологічний матеріал з респіра 4 Проводять підрахунок КІЛЬКОСТІ КЛІТИННИХ елементів у бюптаті слизової оболонки бронха стандартним способом 5 Виявляють наявність циклічних нуклеотидів у зрізах бюптату слизової оболонки бронха методом Кунса стандартним способом 6 Оцінюють інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, порівнюючи КІЛЬКІСТЬ клітинних елементів у бюптаті та рівень циклічних нуклеотидів з тими, що характерні для різних за інтенсивністю запальних процесів при бронхолегеневих захворюваннях, визначаючи інтенсивність запалення як значну чи помірну (Федоров И А Характеристика воспалительного процесса в бронхиальном дереве у детей при тяжелых формах бронхиальной астмы в фазу ремиссии // Пульмонология -1999 -№1 - С 63-67) Суттєвими ознаками аналогу і винаходу, що збігаються є такі 1 Отримання біологічного матеріалу з респіраторного тракту ю 52124 Вказаний спосіб оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях є значною мірою суб'єктивним, через те, що процедура отримання бюптату значною мірою залежить від КЛІНІЧНОГО досвіду дослідника До того ж, отримання напівкількісних даних, які неможливо порівняти з даними практично здорових осіб, негативно впливає на достовірність та точність оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях Нефізюлопчна процедура отримання бюптату слізової оболонки бронха значно змінює його метаболічну активність, що в першу чергу позначається на рівні та співвідношенні циклічних нуклеотидів Таким чином, вміст вказаних метаболітів не може достовірно і точно відображати інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, а значна доля суб'єктивізму при проведенні аналізу парафінових зрізів, заважає достатній відтворюваності результатів оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях процедури отримання слини для КІЛЬКІСНОГО аналізу, та наявність різноманітних чинників, які спроможні впливати на розчинність видихаємого повітря в слині До того ж рівень нітрит-юнів у слині значною мірою залежить від стану слизової оболонки порожнини рота, а також від надходження оксиду азоту та його метаболітів із носової порожнини У вказаному способі відсутній етап конверсії нітрат-юнів слини у нітрит-юни, що значно погіршує точність оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, бо відомо, що рівень продукції оксиду азоту в організмі прямо пропорційний вмісту його кінцевих метаболітів нітрит- та нітрат-юнів Відсутність етапу депротеїнізацм зразка слини також негативно відображається на точності та достовірності оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, через те, що продукти білкового метаболізму спроможні впливати на оптичну ЩІЛЬНІСТЬ реакційної суміші, яка реєструється при 540нм Найбільш близьким за технічною суттєвістю та досягаємим результатом є спосіб оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, що полягає у наступному 1 Отримують біологічний матеріал з респіраторного тракту - видихаєме повітря, розчинене у слині, стандартним способом 2 Аналіз слини проводять не пізніше 3-5 хвилин після отримання 3 Слину фільтрують через ватний тампон 4 До зразка слини об'ємом 50 мкл у мікрокюветі додають 50мкл реактиву Gness 5 Інкубують 10 хвилин при 22°С 6 Реєструють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ реакційної суміші при 540нм, за допомогою фотоелєктроколориметричного рідера 7 Визначають вміст нітрит-юну по калібровочній кривій стандартним способом 8 Оцінюють інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях при рівні нітрит-юнів, більшому, ніж той, що встановлений у практично здорових осіб (Назаретян Э Е , Нариманян М 3 , Мартиросян Т В , Гаспарян А Ю Содержание окиси азота в слюне и легочная гипертензия у больных с различной степенью тяжести бронхиальной астмы // Пульмонология 2000 - №2 - С 23-27) Спільними суттєвими ознаками прототипу і способу, що заявляється є 1 Отримання зразка видихаємого повітря 2 Додавання до реакційної суміші реактиву Gness 3 Реєстрація оптичної ЩІЛЬНОСТІ реакційної суміші при 540нм за допомогою фотоел є ктро кол ориметричногорідера 4 Визначення вмісту нітрит-юнів Беручи до уваги нешвазивність, безпечність для здоров'я обстежуваного та простоту виконання даного способу оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, він вимагає деяких принципових зауважень Використання в якості зразка видихаємого повітря - слини, як матеріалу для дослідження рівня нітрит-юнів, не дає змоги отримувати достатньо достовірні результати, через неможливість стандартизації В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, шляхом зміни методики забору зразка видихаємого повітря, проведення додаткових етапів лабораторного дослідження, що дозволить підвищити точність, достовірність та відтворюваність результатів дослідження Поставлене завдання вирішується тим, що в способі оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, шляхом отримання зразка видихаємого повітря, додавання до реакційної суміші реактиву Gness, реєстрації оптичної ЩІЛЬНОСТІ реакційної суміші при 540нм за допомогою фотоелеісгроколориметричного рідера, та визначення вмісту нітрит-юнів, новим є те, що для отримання зразка видихаємого повітря використовують його конденсат, шляхом видихання повітря на поверхню охолодженої чашки Петрі, депротеїнізують конденсат видихаємого повітря розчинами сульфату цинку і гідроксиду натрію, конвертують нітрат-юни у нітрит-юни за допомогою металевого кадмію та оцінюють інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях при ВМІСТІ нітрит-юнів в межах 2,234,56мкМ - як незначну, в межах 4,57-10,12мкМ - як середню, в межах більше 10,13мкМ - як високу Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом, що досягається, полягає у наступному для оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях визначають вміст кінцевих метаболітів оксиду азоту нітрит- і нітрат-юнів у конденсаті видихаємого повітря Відомо, що рівень вказаних кінцевих метаболітів оксиду азоту в організмі прямо пропорційний продукції оксиду азоту, який у великій КІЛЬКОСТІ продукується клітинами неспецифічного захисту при запальних процесах Значне збільшення продукції оксиду азоту пов'язане з експресією індуцибельної ізоформи синтази оксиду азоту, є показником запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях Індукторами експресії даної ізоформи синтази оксиду азоту в клітинах неспецифічного захисту є бактеріальні 52124 ліпополісахариди та цитокши штерлейкін-1, гамаштерферон, фаісгор некрозу пухлин-альфа, рівень яких значно збільшується в умовах розвитку запалення При цьому, інтенсивність продукції оксиду азоту залежить виключно від інтенсивності запалення при бронхолегеневих захворюваннях Оксид азоту є важливим внутрішньо- і МІЖКЛІТИННИМ посередником здійснення багатьох життєво важливих функцій в організмі, серед яких - регуляція функціонального стану епітелію і гладеньком'язових клітин респіраторного тракту, шляхом модуляції активності гуанілатциклази, потужна мікробіцидна активність та здатність регулювати функціонально-метаболічний стан клітин неспецифічного захисту Неповний перелік проявів функціональної активності оксиду азоту, вказає на ДОЦІЛЬНІСТЬ визначення його рівня у конденсаті видихаємого повітря для оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях Відомо, ЩО конденсат видихаємого повітря, крім розчинених летючих сполук, містить також білкові молекули (адренокортикотропний гормон, кортизол та ш ), які можуть зменшити відновлювальну здатність гранул металічного кадмію Тому процедура проведення депротеїнізацм конденсату видихаємого повітря є важливим етапом при визначенні рівня кінцевих метаболітів оксиду азоту в організмі Так само важливим етапом є конверсія нітрат-юнів у нітрит-юни Визначення лише рівня нітрит-юнів не дає змоги точно і достовірно оцінити продукцію оксиду азоту в організмі людини, через те, що значна частина нітрит-юнів окислюється далі до нітрат-юнів У зв'язку з цим необхідно проводити конверсію нітрат-юнів до нітрит-юнів за допомогою гранул металевого кадмію Таким чином, дослідження рівня продукції оксиду азоту за вмістом кінцевих метаболітів його у конденсаті видихаємого повітря, з обов'язковим проведенням додаткових етапів лабораторного дослідження депротеїнізацм досліджуваного зразка та конверсії нітрат-юнів до нітрит-юнів у ньому, дозволить значно підвищити точнисть, достовірність та відтворюваність способу оцінки інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях Для визначення показника норми, нами було обстежено 35 практично здорових осіб Серед обстежених були представлені різні ВІКОВІ групи (згідно рекомендацій ВОЗ), середній вік склав 32,2+12,6 роки, жінок було 12 (34,3%), ЧОЛОВІКІВ 23 (65,7%) Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб, вміст нітрит-юнів в конденсаті видихаємого повітря склав 2,23+0,01 мкМ Крім того, було обстежено 62 хворих на бронхіальну астму та встановлено, що у хворих з незначною інтенсивністю запального процесу (17 осіб), рівень нітрит-юнів знаходився в межах 2,23-4,56мкМ, у хворих з середньою інтенсивністю запального процесу (35 осіб) - в межах 4,57-10,12мкМ, при високій інтенсивності запального процесу (10 осіб) - в межах від 10,13мкМ і вище Також нами було визначено вміст нітрит-юнів в конденсаті видихаємого повітря 28 практично здорових дітей, віком від 5 до 15 років, який склав в середньому 4,12+0,02мкМ Спосіб здійснюється таким чином 1 Отримують зразок видихаємого повітря, шляхом його видихання на поверхню охолодженої чашки Петрі впродовж 5 хвилин з середньою частотою (16 - 18 за хвилину) При цьому вдихання і видихання повітря здійснюється через рот 2 Проводять депротеїнізацію конденсату видихаємого повітря, для чого змішують 50мкл отриманого конденсату видихаємого повітря з розчинами сульфату цинку (кінцева концентрація 0,4%) та гідроксиду натрію (кінцева концентрація 27,5мМ) 3 Реакційну суміш ретельно перемішують 4 Центрифугують 20 хвилин при 3000 об/хв 5 Відбирають депротеїнізовану надосадову рідину для подальшого аналізу 6 До 0,25г гранул металевого кадмію додають 0,5мл сірчаної кислоти 7 Гранули ретельно суспендують 8 Центрифугують 1 хвилину при 1500об/хв 9 Надосадову рідину відбирають 10 До осаду гранул кадмію додають дистильованої води і відмивають гранули шляхом центрифугування протягом 1 хвилини при 1500об/хв 11 Процедуру відмивання гранул кадмію проводять тричі дистильованою водою і один раз 0,2М гліцин-пдроксид натрію буферним розчином (рН-9,7) 12 Після останнього відмивання, на досадову рідину повністю відбирають 13 Конвертують нітрат-юни у нітрит-юни, для чого до гранул кадмію додають депротеїнізовану надосадову рідину досліджуваної проби 14 Додають 80мкл 0,6М гліцин-пдроксид натрію буферного розчину (рН-9,7) 15 Інкубують реакційну суміш 20 хвилин при кімнатній температурі (22°С) 16 Центрифугують реакційну суміш 1 хвилину при 1500об/хв 17 До надосадової рідини об'ємом 200мкл, додають реактив Gness у співвідношенні 2 1 18 Інкубують суміш 15 хвилин при кімнатній температурі (22°С) 19 Реєструють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ інкубаційної суміші при 540нм, за допомогою фотоелектроколориметричногорідера 20 Визначають вміст нітрит-юну по калібровочній кривій стандартним способом 21 Оцінюють інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях при рівні нітрит-юнів в межах 2,23-4,56мкМ - як незначну, в межах 4,57-10,12мкМ - як середню, в межах вище 10,13мкМ - як високу Приклад Хворий У 29 років надійшов у алергологічне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні зі скаргами на слабкість, СПІТНІЛІСТЬ, головний біль, періодичне утруднене дихання експіраторного характеру переважно у НІЧНІ години, задуху у спокої та при найменшому фізичному навантаженні, сухий кашель Вказані ознаки порушення функції дихання з'явились вперше За три дні до надходження в клініку, після перенесеної гострої респіраторної вірусної інфекції, з'явилися вищезазначені скарги, виникнення яких хворий пов'язує з 52124 вдиханням парів пента-фталевої фарби та хворий була госпіталізований для лікування загострення захворювання Анамнез життя - без особливостей, спадкової патології в родині не виявлено Пацієнт палить впродовж 10 років, ІНШІ ШКІДЛИВІ ЗВИЧКИ заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений Об'єктивно спостерігаються наступні зміни При огляді відзначається участь допоміжних м'язів в акті дихання При пальпації голосове тремтіння дещо послаблене, верхівковий поштовх визначається нечітко Перкуторно - над всією поверхнею легенів легеневий звук, аускультативно - ДІЯЛЬНІСТЬ серця правильна, тони приглушені, в легенях дихання жорстке, велика КІЛЬКІСТЬ розсіяних сухих та вологих хрипів, більше у нижніх відділах Частота дихання 26 за 1 хвилину, дихання поверхневе Артеріальний тиск у момент надходження 155/95мм рт ст , пульс 76 ударів за хвилину, задовільних властивостей На електрокардіограмі ознаки гіпертрофії міокарду правого шлуночка, порушення процесів реполяризацм в правих грудних відведеннях, неповна блокада правої ніжки пучка Пса При ехокардюграфічному дослідженні спостерігається збільшення порожнини правого шлуночка, потовщення передньої стінки правого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, парадоксальний рух міжшлуночкової перетинки у сістолу, помірне зниження скоротливих властивостей лівого шлуночка При рентгенологічному дослідженні легені без видимих очагово-швільтративних змін, з посиленим судинним малюнком, корені структурні Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження, виникла необхідність додаткових лабораторних досліджень з метою оцінки інтенсивності запального 8 процесу Для цього було проведено дослідження бюптата слизової оболонки бронха стандартним способом Аналіз парафінових зрізів бюптата слизової оболонки бронха виявив незначну КІЛЬКІСТЬ еозинофілів, вміст та співвідношення циклічних нуклеотидів в апудоцитах вказували на незначну інтенсивність запалення у хворого Отримані результати аналізу бюптата слизової оболонки бронха відповідали таким, що є характерними для незначної інтенсивності запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях Але враховуючи дані анамнезу та клінічної картини захворювання, імовірність високої інтенсивності запального процесу була досить великою, тому для оцінки інтенсивності запального процесу був застосований пропонуємий спосіб Після обчислення отриманих результатів вміст нітрит-юнів склав 10,2мкМ, що свідчило про високу інтенсивність запального процесу Це дозволило точно встановити діагноз та призначити курс патогенетичне обумовленої терапії Через три тижні комплексного лікування з включенням засобів, які спроможні були зменшити інтенсивність запального процесу, поряд з поліпшенням клінічної картини захворювання та позитивною динамікою клініко-лабораторних даних, рівень нітрит-юнів в конденсаті видихаемого повітря склав 7,43мкМ, що свідчило про зменшення інтенсивності запального процесу у хворого, до середньої за інтенсивністю Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволяє точно оцінити інтенсивність запального процесу при бронхолегеневих захворюваннях, а у конкретному випадку, дозволило вчасно призначити необхідну терапію і відвернути появу ускладнень ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71