Кондуктометричний ферментний біосенсор для визначення поверхнево-активних речовин у водних розчинах

Кондуктометричний ферментний біосенсор для визначення концентрації поверхнево-активних речовин у водних розчинах, що містить дві пари кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена робоча ферментна мембрана на основі ацетилхолінестерази, що є чутливою до поверхнево-активних речовин, на другу пару нанесена референтна мембрана, а згадані електроди призначені для підключення до відповідних входів кондуктометричної установки. (19) (21) u201002509 (22) 05.03.2010 (24) 25.08.2010 (46) 25.08.2010, Бюл.№ 16, 2010 р. (72) СОЛДАТКІН ОЛЕКСАНДР ОЛЕКСІЙОВИЧ, КУЧЕРЕНКО ІВАН СЕРГІЙОВИЧ, АРХІПОВА ВАЛЕНТИНА МИКОЛАЇВНА, ДЗЯДЕВИЧ СЕРГІЙ ВІКТОРОВИЧ, СОЛДАТКІН ОЛЕКСІЙ ПЕТРОВИЧ (73) ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 як недостатня чутливість та селективність. Крім того біосенсори на основі бактерій складно стандартизувати. А також кондуктометричні методи аналізу на відміну від амперометричних є достатньо простими, зручними, точними та дозволяють вирішити ряд важливих науково-дослідних та виробничих задач [7]. Відомий амперометричний біосенсор для визначення концентрації ПАР у водних розчинах, який має один амперометричний електрод, на який нанесена робоча мембрана на основі бактерій з родів Pseudomonas та Achromobacter, а сам біосенсор призначений для підключення до амперметричної установки [1]. В описаному пристрої застосовують амперометричний метод вимірювання та використання бактерій, основою якого є біоселективний елемент. Біоселективні елементи порівняно з ферментними системами є менш стабільними та значно складнішими. Авторами під час проведення патентноінформаційних досліджень і підготовки цієї заявки не виявлені конструкції кондуктометричних ферментних біосенсорів для визначення концентрації поверхнево активних речовин у водних розчинах. В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу створення кондуктометричного ферментного біосенсору для визначення концентрації поверхнево активних речовин у водних розчинах шляхом застосування кондуктометричного методу вимірювання і створення умов для селективної оцінки вмісту поверхнево активних речовин у досліджуваному зразку, за рахунок використання ферменту в складі біосенсору. Поставлена задача вирішується пропонованим кондуктометричним ферментним біосенсором для визначення концентрації поверхнево активних речовин у водних розчинах, який має дві пари кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена робоча ферментна мембрана на основі ацетилхолінестерази, що є чутливою до поверхнево активних речовин, на другу пару нанесена референтна мембрана, а згадані електроди призначені для підключення до відповідних входів кондуктометричної установки. Серед поверхнево активних речовин, як відомо катіонні поверхнево активні речовини вважаються одними із найбільш шкідливих. Тому було поставлено задачу створити кондуктометричний ферментний біосенсор для визначення поверхнево активних речовин з більш високою порівняно з прототипом селективністю та стабільністю. Необхідну селективність та стабільність роботи пристрою автори отримали завдяки використанню у складі чутливої мембрани ферментної системи, яка є сама по собі є більш стабільною та селективною системою в біосенсориці, а саме фермент ацетилхолінестерази є чутливим до поверхнево активних речовин. Щоб отримати селективний біосенсор, який можна використовувати для роботи з реальними зразками, автори застосували кондуктометричний метод вимірювання. В основі роботи кондуктометричного ферментного біосенсору для визначення поверхнево активних речовин лежить ефект інгібування ацетил 52437 4 холінестерази з наступною ферментативною реакцією: AXE Ацетилхолін + Н2О Холін + CH3COO- + H+ В процесі проходження ферментативної реакції ацетилхолінестераза розщеплює ацетилхолін, при цьому змінюється концентрація заряджених іонів в робочій мембрані, яку і можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача [8]. Далі перевіряли реакцію ферментного біосенсору на досліджуваний розчин з можливим вмістом в ньому поверхнево активних речовин. В ході цього впливу поверхнево активні речовини інгібують роботу фермента. Відповідно, по ходу ферментативної реакції, при наявності інгібіторів, генерується вже менше заряджених іонів, що призвело до зміни провідності розчину, але у меншій мірі ніж спочатку. В залежності від цієї різниці і визначали наявність поверхнево активних речовин в досліджуваному зразку. Ферментативна система вибиралась авторами експериментальне за умов отримання покращених аналітичних характеристик біосенсору таких як селективність, операційна стабільність, та відтворюваність сигналу, а також мінімальної собівартості. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де на фіг. 1 схематично показано пропонований кондуктометричний ферментний біосенсор для визначення концентрації поверхнево активних речовин у водних розчинах; на фіг. 2 показана блок-схема кондуктометричної установки; на фіг. 3 продемонстровано принцип роботи кондуктометричного ферментного біосенсору для визначення поверхнево активних речовин на реальному прикладі проведення експерименту; а на фіг. 4 наведено калібрувальний графік залежності швидкості зменшення відгуку біосенсору від концентрації бензалконіум хлориду (поверхнево активна речовина). Кондуктометричний біосенсор для визначення концентрації поверхнево активних речовин у водних розчинах складається з двох пар електродів 1 та 2 (фіг. 1). На одну пару електродів 1 нанесена робоча мембрана 3. На другу пару електродів 2 нанесена референтна мембрана 4. Згаданий біосенсор підключений до кондуктометричної установки (фіг. 2). Робоча мембрана 3 містить у собі фермент ацетилхолінестеразу, селективний до поверхнево активних речовин. Кондуктометрична установка містить блок 5 для реєстрації сигналів біосенсору /РБ/, низькочастотний генератор сигналів 6 /ГС/ (типу Г3-118 /Україна/), фазочутливий нановольтметр 7 /НВ/, диференційний підсилювач 8 /ДП/, опори навантаження 9, призначені для з'йому з них сигналів з відповідних пар електродів та вимірювальну комірку 10. Входи низькочастотного генератора сигналів 6 /ГС/ (типу Г3-118 /Україна/) підключені до відповідних електродів кондуктометричного біосенсору. Виходи генератора сигналів 6 /ГС/ підключені до 5 входу фазочутливого нановольтметра 7 /НВ/. Виходи нановольтметра 7 /НВ/ підключені до реєстраційного блоку 5 /РБ/, призначеного для реєстрації сигналів з біосенсору. При цьому входи нановольтметра 7 /НВ/ через диференційний підсилювач 8 /ДП/ підключені до відповідних пар електродів біосенсору, які розташовані у вимірювальній комірці 10. Пропонований кондуктометричний ферментний біосенсор на основі інгібіторного аналізу для визначення поверхнево активних речовин (ПАР) працює так. На робочу поверхню однієї пари електродів 1 кондуктометричного біосенсора наносили вихідну суміш для створення робочої мембрани 3 (об'єм 50 нл), яку вносили в пари глутарового альдегіду (ГА) на 20-30 хвилин. Цю робочу мембрану готували із 20 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): - 3-6 Ацитилхолінестерази (АцХЕ), - 3-6 сироватковий альбумін бика (БСА), - 8-18 гліцерин. На другу пару електродів 2 наносили вихідну суміш для створення референтної мембрани 4 (50 нл), яку вносили в ГА на 20-30 хвилин, цю мембрану формували з 20 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): - 6-12 БСА, - 8-18 гліцерин. З генератора 6 на електроди біосенсору 1 та 2, що утворюють диференційну пару і знаходяться в комірці 10 з розчином, що досліджується, подавали змінну напругу з частотою 100 кГц та амплітудою 10 мВ. При цьому із згаданих електродів 1 та 2 отримували сигнали, які знімалися з опорів навантаження 9 (RH = 1 кОм) та надходили через диференційний підсилювач /типу Unipan-233-б (Польща)/ 8 до селективного нановольтметра /типу Unipan-233 (Польща)/ 7. Після нановольтметра 7 сигнал подається до реєстраційного блоку 5 для реєстрації сигналу біосенсору кондуктометричної вимірювальної установки, в якій відбувалося перерахування даних та отримання сигналу, який відповідає концентрації поверхнево активних речовин у досліджуваному водному розчині. Пропоновану систему використовували так. Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Створення ферментного біосенсору: виготовляли робочу мембрану 3. Для цього готували розчин з вмістом 5 % Ацетилхолінестерази (АцХЕ), 5% БСА та 10 % гліцерину у 20мМ фосфатному буфері, рН 6,5 . Референтну мембрану 4 виготовляли таким же чином, але замість наважки ферменту брали лише 10 % БСА. Гліцерин у складі мембран 3, 4 використовувався для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасного підсихання розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, БСА в складі робочої мембрани 3 відігравав роль стабілізуючого агенту для ферменту. Для створення мембран біосенсору, відповідно, 3 та 4, краплю суміші АцХЕ-БСА (50 нл) нано 52437 6 сили на одну частину чутливої поверхні перетворювача 1, а на іншу 2 - розчин БСА без ферменту (це був датчик порівняння). Для іммобілізації мембран датчики розміщували в атмосфері насичених парів глутарового альдегіду (ГА) на 20-30 хв. і потім підсушували на повітрі й відмивали від надлишку ГА у буферному розчині протягом 10-20 хв. Протокол аналізу поверхнево активних речовин представлено на прикладі бензалконіум хлорида (поверхнево активна речовина) в модельних розчинах. Спочатку отримували залежність швидкості зменшення величин відгуків біосенсору на ацетилхолінхлорид після додавання в розчин різних концентрацій бензалконіум хлориду одержували калібрувальний графік (фіг. 4). Для перевірки роботи пропонованого кондуктометричного ферментного біосенсору з реальними зразками, готували розчин з умовно невідомою концентрацією бензалконіума хлориду. За допомогою біосенсору отримували сигнал на внесення до вимірювальної комірки 2,5 мМ ацитилхолінхлориду. Потім до вимірювальної комірки додавали розчин з умовно невідомою концентрацією бензалконіум хлориду. Починає зменшуватись відгук біосенсору на субстрат з відповідною швидкістю. В залежності від цієї швидкості, по калібрувальному графіку отримували концентрацію бензалконіум хлориду, яка співпадала з умовно невідомою концентрацією бензалконіум хлориду у розчині. Таким чином, пропонований кондуктометричний ферментний біосенсор є функціонально придатним і дозволяє проводити експрес-аналізи рідин з можливістю визначення концентрації поверхнево активних речовин в реальних водних розчинах. Джерела інформації: 1. L. Taranova, I. Semenchuk, T. Manolov, P. Iliasov, A. Reshetilov. Bacteria-degraders as the base of an amperometric biosensor for detection of anionic surfactants. // Biosensors and Bioelectronics - 2002, 17, - P. 635-640. 2. L. Perez, A. Pinazo, M. T. Garcia, M. Lozano, A. Manresa, M. Angelet, M. P. Vinardell, M. Mitjans, R. Pons, M. Infante. Cationic surfactants from lysine: Synthesis, micellization and biological evaluation. // European Journal of Medicinal Chemistry -2009, -44, -P. 1884-1892. 3. A. Seki, К. Tokita. Surfactant cytotoxicity assay based on a silicon transducer. // Chemosphere 2009, - 76, - P. 341-344. 4. L. Taranova, A. Fesay, G. Ivashchenko, A. Reshetilov, M. Winther-Nielsen, J. Emneus. Comamonas testosteroni strain ТІ as a potential base for a microbal sensor detecting surfactants. // Applied Biochemistry and Microbiology - 2004, - 40, -P. 404408. 5. Y. Nomura, К. Ikebukuro, К. Yokoyama, Т. Takeuchi, Y. Arikawa, S. Ohno, I. Karube. Application of a linear alkylbenzene sulfonate biosensor to river water monitoring. // Biosensors and Bioelectronics 1998, -13, -P. 1047-1053. 6. A. Reshetilov, I. Semenchuk, P. Iliasov, L. Taranova. The amperometric biosensor for detection of sodium dodecyi sulfate. // Analytica Chimica Acta 1997, -347, -P. 19-26. 7 52437 7. Дзядевич С.В. Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування. // Біополімери і клітина - 2005, -21, -с. 91-106. 8. Дзядевич С. В., Шульга А. А., Пацковский С. В., Архипова В. Н., Солдаткин А. П., Стриха В. И. Комп’ютерна верстка І.Скворцова 8 Тонкопленочные кондуктометрические датчики для ферментативных биосенсоров. // Электрохимия - 1994, -30, -с. 982 - 987. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601