Спосіб гальмування процесу дисемінації експериментальної карциноми

Спосіб гальмування процесу дисемінації експериментальної карциноми шляхом хірургічного видалення пухлини та інгібування активності систем судинно-тромбоцитарного та коагуляційного гемостазу, який відрізняється тим, що за 2-3 години до операції та протягом 6 діб післяопераційного періоду вводиться низькомолекулярний гепарин, наприклад надропарин кальцію, а з 7 до 21 доби після операції застосовується інгібітор агрегації тромбоцитів, наприклад тиклопідин Винахід відноситься до галузі онкологи, а саме експериментальної онкології Ракові клітини, що циркулюють в крові, виділяють проагреганти та прокоагулянти У процесі метастазування пухлинні клітини взаємодіють між собою, активованими тромбоцитами, нитками фібрину із утворенням тромбоонкогенних емболів, які адгезують до інтими судин мікроциркуляцм Це сприяє їх імплантації та має вирішальне значення у частоті виникнення метастазів ВІДПОВІДНО, зменшення адгезивно-агрегаційних властивостей тромбоцитів та рівня фібриноутворення може сприяти гальмуванню процесу метастазування злоякісних пухлин В експерименті (Schwalke MA, Tzanakakis GN, Vezendis MP Effects of prostacyclm on hepatic metastases from human pancreatic cancer in the nude mouse J Surg Res 1990,49 164-7) проведено вивчення впливу інгібітору агрегації тромбоцитів простацикліну на процес метастазування в печінку ракової пухлини підшлункової залози у модельній системі на голих мишах У контрольній групі (без лікування) загальна площа поверхні печінки, уражена пухлинним процесом, складала 485мм2 У тварин, яким за ЗОхв до ін'єкції пухлинних клітин вводилося 200нг простацикліну, площа метастатичного ураження печінки становила лише 21мм2 Максимальне зменшення пухлинної поверхні печінки (до 11мм2) спостерігалося при введенні даної дози препарату за ЗОхв до та через 4 год після ін'єкції тваринам пухлинних клітин Дані результати показали, що простациклін має статистично достовірний гальмівний вплив на розвиток печінкових метастазів при панкреатичній аденока рциномі Недоліком даного прототипу є те, що умови експерименту не були наближені до клінічної ситуації, коли в організмі має місце розвинута первинна пухлина Наступним прототипом (Schirner M, Schneider MR The prostacyclm analogue cicaprost inhibits metastasis of tumour of R 3327 MAT Lu prostate carcinoma and SMT 2A mammary carcinoma J Cancer Res Clm Oncol 1992, 118 497-501) є дослідження впливу інгібітору тромбоцитарної агрегації цикапросту на прогресування експериментальної карциноми молочної залози SMT 2A, яка переважно метастазує в легені та лімфовузли Введення цикапросту знижувало середню КІЛЬКІСТЬ метастазів перещепленої карциноми У щурів контрольної групи налічувалося від 10 до 45 легеневих метастазів, тоді як серед тварин, що отримували цикапрост, у 5 з 10 особей метастази не визначалися, а у інших 5 була тільки невелика КІЛЬКІСТЬ метастатично уражених лімфовузлів Недоліком даного прототипу є те, що у ході експерименту не проводилося лікування самої первинної пухлини, застосовувався вплив лише на тромбоцитарну ланку гемостазу, були відсутніми дії по відношенню до коагуляційної ланки системи гемостазу (інгібування фібриноутворення), яка теж відіграє важливу роль у процесі метастазування Наступним прототипом є застосування інгібітору агрегації тромбоцитів цикапросту на моделі карциноми молочної залози МТІ_пЗ у щурів (Schirner M, Lichtner RB, Schneider MR The stable prostacyclm analogue cicaprost inhibits metastasis to Ю Ю 54275 lungs and lymph nodes in the 13762NF MTLn3 rat mammary carcinoma Clm Exp Metastasis 1994, 12 24-30) Цикапрост застосовувався з 11 доби після імплантації пухлини до закінчення експерименту (21 доба) Терапію було розпочато тоді, як пальпувалася первинна пухлина та інфільтровані, метастатично вражені лімфовузли Цикапрост, який давався тваринам у щоденній пероральній дозі 0,1мг/кг, суттєво знижував середню КІЛЬКІСТЬ метастазів (до 20), у порівнянні з більш ніж 500 метастазами у тварин контрольної групи Хірургічне видалення первинної пухлини на 12 добу статистично не впливало на цей показник Пероральне застосовування цикапросту супроводжувалося зменшенням середньої КІЛЬКОСТІ метастазів у лімфовузли, причому у 43% тварин метастази взагалі не визначалися Вага метастатично уражених легень виявилася зменшеною, на 50% знизилася маса іпсілатеральних та контралатеральних аксилярних метастатично уражених лімфовузлів Недоліком даного прототипу є те, що антиметастатичну активність тромбоцитарного антиагреганту досліджено лише при запущених стадіях пухлинного процесу, тобто при наявності метастазів у лімфовузлах Також не чинилося впливу на коагуляційну ланку системи гемостазу (з метою зниження утворення фібрину) В експерименті застосовувався несучасний інгібітор агрегації тромбоцитів, що блокує циклооксигеназний шлях активації тромбоцитів Значне зменшення продуктів метаболізму арахідонової кислоти може чинити дестабілізуючий вплив на первинний гемостаз, знижувати активність імунних реакцій та призводити до розвитку побічних ефектів (ерозій слизової шлунку і кишківника, геморагій і т ш ) Задачею заявляемого винаходу є досягнення зниження рівня дисемінації злоякісної пухлини в експерименті шляхом хірургічного видалення первинної пухлини та інгібування активності системи судинно-тромбоцитарного та коагуляційного гемостазу Заявлена задача досягається тим, що за 2 - З години до операції та протягом 6 діб післяопераційного періоду вводиться низькомолекулярний гепарин, наприклад, надропарин кальцію, а з 7 до 21 доби після операції застосовується інгібітор агрегації тромбоцитів, наприклад, тіклопідін У роботі використовувались миші лінії С57ВІ/6, масою 20 - 25г, розводки віварію Інституту експериментальної патологи, онкології та радіобіології їм Р Є Кавецького НАН України Експериментальною моделлю служила легенева карцинома Льюіс Перещеплення пухлини проводилося введенням 0,01 - 0,02мл суспензії пухлини (2 • 105 клітин) В подушечку лапки тварин На 18 - 19 добу після трансплантації, коли первинна пухлина досягала об'єму 0,8 - 1,0см3, лапка з пухлиною видалялася Тварин розділено на дві групи дослідну та контрольну Мишам дослідної групи за 2 год до операції підшкірно вводилося ЗМО надропарину кальцію Дану разову дозу отримували шляхом розведення 0,3мл препарату активністю 7500МО у 25мл фізіологічного розчину, 0,01 мл якого вводилося миші Після видалення пухлини ін'єкції надропарину кальцію проводили раз на день протягом 6 діб Після ВІДМІНИ надропарину кальцію, 7 до 21 доби включно, тваринам внутрішньом'язево раз на день вводився ТІКЛОПІДІН у дозі 0,8мг Для отримання даної дози таблетку препарату масою 250мг розчинювали у ЮОмл фіз розчину, 0,3мл якого і відповідало шуканій дозі Контрольною служила група мишей, яким виконували операцію по видаленню карциноми, але не вводили низькомолекулярного гепарину та тромбоцитарного анти а греганту У певні терміни досліду, а саме до видалення пухлини, на 3, 7, 14 та 21 добу після операції мишей забивали шляхом декапітацм і вилучали кров Вимірювали розміри метастатичних вогнищ на поверхні легень тварин та вираховували сумарний об'єм легеневого метастазування Для контролю активності злоякісного процесу використовували визначення об'єму легеневого метастазування та пухлинного анпогенного фактору (продукується пухлинними клітинами з метою індукції неоанпогенезу у ракових вогнищах) Об'єм легеневого метастазування визначали шляхом вимірювання розмірів кожного метастазу на поверхні легень миші, визначення його об'єму та підсумовування об'ємів усіх метастазів Рівень пухлинного анпогенного фактору досліджували в сироватці крові мишей імуноферментним методом Динаміку об'єму легеневого метастазування у мишей із карциномою Льюіс під впливом лікування відображено в таблиці 1 На 18 добу після перещеплення пухлини (тобто, "до операції") метастази в легенях мишей візуально не визначалися, що не заперечує наявності мікрометастазів На третю добу після операції у легеневій тканині відзначалися метастатичні вогнища, що говорить про дисемінацію пухлинного процесу У наступні терміни обстеження спостерігалося подальше поширення злоякісного процесу Як видно з таблиці, приріст об'єму легеневого метастазування у ДОСЛІДНІЙ групі на 7 добу по відношенню до третьої склав 11,7мм3 (71,8%), на 14 добу в порівнянні з 7-ю 8,0мм3 (28,6%), а на 21 добу після операції - 15мм3 (41,7%) порівняно з 14 добою Для контрольної групи збільшення даного показника становило - на 7 добу після операції порівняно з третьою 38,6мм3 (197,9%), на 14 добу у порівнянні з 7-ю 25,9мм3 (44,6%) та на 21 день після операції у порівнянні з 14-м - 15 мм3 (42,9%) Хоча процеси пухлинної дисемінації мали місце у всіх тварин, але простежувалися певні ВІДМІННОСТІ В ДОСЛІДНІЙ та контрольній групах Так, різниця між показниками контрольної та дослідної групи склала на 3 добу після операції склала 16,4% На 7 добу після операції спостерігалось подальше зростання об'єму легеневого метастазування в обох досліджуваних групах, однак відмічалося збільшення різниці між показниками контрольної та дослідної груп, у ДОСЛІДНІЙ групі об'єм легеневого метастазування був на 51,8% меншим На 14 добу, на тлі зростання об'єму легеневого метастазування в обох групах, різниця показників між контрольною та дослідною групою тварин становила 57,14% Отже у групі, де застосовувався надропарин кальцію, а після ВІДМІНИ останнього, з 7 доби після операції почали вводити ТІКЛОПІДІН, отримано зменшення рівня метастазування На 21 добу рівень метастатичного враження легень у тварин контрольної групи був 54275 на 57,5% вищим порівняно з дослідною групою Тобто, у тварин, яким застосовували низькомолекулярний гепарин у комплексі з тромбоцитарним антиагрегантом, простежувався процес редукції легеневого метастазування В таблиці 2 представлено результати дослідження рівня анпогенного фактору карциноми Льюіс До операції цей показник практично не відрізнявся у тварин контрольної та дослідної груп На 3 добу після операції рівень анпогенного фактору у ДОСЛІДНІЙ групі був меншим за доопераційний на 136,48нг/мл (84,1%), а у мишей контрольної групи на 141,98нг/мл (83,0%) Ці факти пояснюються різким зменшенням пухлинної маси після операції У наступні строки дослідження мало місце поступове зростання даного показника Приріст АФ у мишей дослідної групи на 7 післяопераційну добу по відношенню до третьої склав 3,18нг/мл (12,3%), на 14 добу він зменшився на 1,70нг\мл (5,9%) порівняно з 7-ю добою, а на 21 добу після операції зріс по відношенню до показника 14-і доби на 10,8нг/мл (15,4%) У контрольній групі тварин приріст АФ становив 7,89нг/мл (27,2%) на 7 післяопераційну добу порівняно з третьою, 6,11нг/мл (16,6%) на 14 добу в порівнянні з 7-ю, та 55,98нг/мл (130,1%) на 21 добу після операції по відношенню до 14-І У всіх випадках різниця між значеннями рівня анпогенного фактору була високодостовірною (р < 0,001) При аналізі динаміки змін рівня анпогенного фактору в сироватці крові мишей простежувалися певні ВІДМІННОСТІ МІЖ ДОСЛІДНОЮ та контрольною групою Так, на 3 добу після операції у тварин дослідної групи даний показник був менший, ніж у контрольній, на 11,0% На 7 післяопераційну добу відбувалося зростання даного показника в обох досліджуваних групах, що свідчить про збільшення пухлинного навантаження внаслідок прогресування требуется злоякісного процесу Однак у групі тварин, яким вводився надропарин кальцію, рівень анпогенного фактору був меншим на 21,4% порівняно з контрольною групою У подальший термін обстеження, а саме на 14 добу після видалення пухлини, виявлено, що концентрація анпогенного фактору в крові мишей дослідної групи була на 36,5% меншою по відношенню до контрольної, що говорить про суттєве зниження його продукції клітинами карциноми Льюіс у групі мишей, які отримували надропарин кальцію та, з сьомої післяопераційної доби - тіклоПІДІН На 21 добу після операції показники рівня анпогенного фактору у мишей обох груп збільшилися, але приріст виявився значно нижчим у тих випадках, де застосовувався надропарин кальцію в комплексі з тіклопідіном Різниця у концентрації анпогенного фактору в крові тварин дослідної групи у порівнянні з контролем склала 61,5% При цьому у всіх випадках р < 0,005 Схема, що включає видалення первинної пухлини, введення низькомолекулярного гепарину, зокрема, надропарину кальцію, а також інгібітору агрегації тромбоцитів, зокрема, тіклопідшу, відрізняється інгібуючою дією на процес дисемінації карциноми Льюіс За рахунок блокування низькомолекулярним гепарином утворення активного X фактору згортання крові відбувається гальмування фібриноутворення, яке при злоякісному процесі завжди активується раковими прокоагулянтами Введення тромбоцитарного антиагреганту нового покоління тіклопідшу, який за механізмом дії є конкурентним інгібітором рецепторів плазмалеми кров'яних пластинок (що робить неможливим контакт останніх із АДФ (агоністтромбоцитарної агрегацій) та фібриногеном), знижує процес активації тромбоцитів та їх адгезивно-агрегаційну здатність та має найменшу побічну дію серед відомих антиагрегантів За рахунок гальмування активності як коагуляційної так і тромбоцитарної ланок системи гемостазу ми, найімовірніше, добиваємося порушення формування тромбоонкогенних конгломератів у системі циркуляції, що складаються з циркулюючих ракових клітин, фібрину і тромбоцитів, а також процесів адгезії цих новоутворень до судинної стінки та імплантації в навколишні тканини Не виключено, що також відбувається порушення процесів неоваскуляризацм у новостворених метастазах за рахунок зменшення фібриноутворення Таблиця 1 Зміни об'єму легеневого метастазування у мишей із карциномою Льюіс після видалення первинної пухлини та застосування надронарину кальцію та тіклопідшу, мм3 Групи ДГЗ(п = 15) КГ(п = 10) Періоди обстеження До операції 0 0 Р 3 доба Р 7 доба Р 14 доба Р 21 доба < 0,001 16,3 ±0,16 < 0,001 28,0 ± 0,23 < 0,001 36,0 ±0,2 < 0,001 51,0 ±0,1 < 0,001 19,5 ±0,1 < 0,001 58,1 ±0,2 < 0,001 84,0 ±0,3 < 0,001 120,0 ±0,2 Примітка п - КІЛЬКІСТЬ тварин 54275 Таблиця 2 Зміни рівня ангіогенного фактору у мишей із перещепленою карциномою Льюіс після видалення первинної пухлини та застосування надропарину кальцію та тіклопідіну, нг/мл сироватки крові Групи До операції Р ДГЗ (п = 162,30 ±1,6 < 0 001 15) КГ(п = 10) 171,00 ± 0,014 < 0 001 3 доба 25,82 ± 0,01 29,02 ± 0,01 Періоди обстеження 7 доба Р 29,00 ± < 0 001 < 0,001 0,02 35,9 ± < 0 001 < 0,001 0,02 р Примітка п - КІЛЬКІСТЬ тварин ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24 14 доба 27,30 ± 0,1 43,02 ± 0,01 Р < 0 001