Спосіб одержання меланінвмісної біомаси з використанням штаму мікроміцета cladosporium cladosporioides 396

Спосіб одержання меланшвмісної біомаси, що включає приготування поживного середовища, засів його штамом мікроміцета Cladosponum cladosponoides 396 з подальшим проведенням ферментації в умовах глибинного культивування, який відрізняється тим, що засів поживного середовища здійснюється інокулюмом мікроміцета Cladosponum cladosponoides 396 в КІЛЬКОСТІ 10-15 об %, а як поживне середовище для вирощування шокулюму та цільового продукту використовують середовище такого складу (г/л) картопля 50 харчовий цукор 15 вода дистильована 1л Винахід відноситься до галузі прикладної мікробіологи і біотехнологм і стосується мікробіологічного способу одержання меланшвмісної біомаси, використовуючи штам мікроміцета Cladosponum cladosponoides 396 Меланінвмісна біомаса необхідна для отримання в подальшому меланшового пігменту, який широко розповсюджений в природі, приймає участь в гумусоутворенні грунту, обумовлює загар, колір волосся і очей людини, забарвлення шкірного покрову тварин, пір'я птахів, насіння тощо (С П Лях Микробный меланиногенез и его функции — М Наука, 1981 — 274 с , Н Н Жданова, А И Василевская Меланинсодержащие грибы в экстремальных условиях — К Наук думка, 1988 —196 с ) Меланшовий пігмент пропонується використовувати як перетворювач електромагнітних і ультразвукових опромінень в теплову енергію (Патент России № 2028157, МПК А61К 41/00, Патент России № 93049670, МПК А61К 41/00), стимулятор росту рослин (Патент России № 940305551, МПК С12 N1/14), антиоксидантний, протипухлинний та радюпротекторний препарат (А А Малама, Л А Смирнова Влияние циклических соединений на образование пигмента в культурах Aspergillus niger // Прикладная биохимия и микробиол — 1975 — 11, № 1 — С 57 - 62, Д Г Затула, А Т Слабоспицька, А А Свищук, Н М Жданова Протипухлинні властивості меланшових пігментів грибного походження та їх вплив на деякі реакції імунітету // Мікроб журн — 1976 — 38, № 1 — С 29 - 32, Патент СССР № 1787032, МПК А 61 К 35/55, М О Дружина, Г Г Пухова, А П Бурлака, Н М Жданова, Є П Сидорик Процеси перекисного окислення в системі крові та їх корекція меланіном у тварин в зоні впливу аварії на Чорнобильській АЕС // Український радіологічний журнал — 1994 — 3, №4С 271 - 273, Патент России № 96104228, МПК С12Р 17/10, Патент России № 96104229, МПК С12Р 17/10) та інше Відомо, ЩО застосування матеріалів тваринного походження для одержання меланшвмісної біомаси занадто дороге і практично недоступне Використання для його одержання плодів винограду і сухого листя чаю практично невигідно через обмеженість продукції (залежність від одержаного врожаю) і її непостійність (Ю Л Жеребин Окислительно-восстановительные полимеры из виноградных выжимок//ДАН СССР —1981 — 259, № 4 — С 853 - 856, Д А Новиков, В П Курченко, И И Азарко Фотопротекторные свойства меланинов из винограда (Vitis vimfera) и черного чая // Радиационная биология Радиоэкология — 2001 — 41, № 6 — С 664 - 670) Економічно вигідніше меланінвмісну біомасу одержувати мікробіологічним шляхом, культивуючи на поживних середовищах мікроорганізми, що мають сталі морфолого-культуральні властивості, які можна постійно контролювати Так, є спосіб, в якому меланінвмісну біомасу отримують за допомогою штаму дріжджів Saccharomyces neoformans var mgncans, культивуючи його на середовищах, 1^ го Ю 57317 становив 15 - 20г/л Недоліком цього способу одедля приготування яких використовують відходи ржання меланінвмісної біомаси є використання в спиртового виробництва, молочну сироватку, мепоживному середовищі кукурудзяного екстракту, лясу (Патент России, № 2000124690, МПК С12Р що є дорогою речовиною з непостійним компонен7/24) На таких середовищах вихід біомаси низьтним складом Крім того, для одержання біомаси кий (4%) поживне середовище засівали суспензією КОНІДІЙ Відомо також спосіб, в якому використовують або фрагментованим міцелієм вихідної культури штам Streptomyces, одержаний методами генної гриба і не застосовували вирощування в глибинінженери, що вирощують на середовищі, до складу них умовах шокулюму гриба, що призводило до якого входить гідролізат казеїну чи казеїнового витрачання великих об'ємів поживного середовипептону, сульфат МІДІ І L-тирозин (Патент US № ща і лабораторного посуду 5631151, МПК 6С 12 Р 7/66) Крім того, є способи одержання біомаси штаму Задачею запропонованого винаходу є вдоскоантарктичних чорних дріжджів Nadsomella mrga налення способу одержання меланінвмісної біоvar hesuehca 365 та його мутанта 1-365 (Заявка маси з використанням штама мікроміцета России № 96104228, МПК С12 Р 17/10, Заявка Cladosporium cladosporioides 396 Поставлена заРоссии № 96104229, МПК С12 Р17/10) та штамів дача вирішується тим, що одержують меланінвмічорних дріжджеподібних грибів Aureobasidium pulсну біомасу гриба Cladosporium cladosporioides 396 lulans (Е Р Алексанян, Л С Маркосян Влияние на поживному картопляно-цукровому середовищі, источников углерода на синтез внеклеточной инщо здешевлює його вартість, а також змінюють вертазы, белка, пигмента и биомассы A pullulans // умови посіву гриба шляхом вирощування в глиМикробиология — 1985 — 54, № 1 — С 49 - 54, бинних умовах шокулюму, встановлюють його опПатент России, № 1559717, Н П Елинов, Н А Юртимальну КІЛЬКІСТЬ, що економить КІЛЬКІСТЬ витралова Меланиновый пигмент Aureobasidium (Pulluченого середовища і лабораторного посуду lana) pullulans Arnaud (de Вагу), 1910 // Научн доШтам мікроміцета Cladosporium кл высш шк Биол Науки —1976, № 7 — С 108 cladosporioides 396 (Fresen) de Vnes вилучений - 112, НА Юрлова Микромицеты рода AureobasiH M Ждановою в 1957 р з чорноземного грунту dium Viala & Boyer Таксономия, экзополисахариУкраїни (Львівська обл , с Пікуловичі) Штам іденды Автореф дис д-ра биол наук — Пущино, тифікований Н М Ждановою Депонований в Ін1997 — 3 1 с ) Однак при використанні даних гриституті мікробіологи і вірусологи НАН України під бів наявність значної КІЛЬКОСТІ екзогенного полісаномером 1MB F-100010 і зберігається в колекції хариду в біомасі призводить до багаторазового м грибних культур відділу фізіологи та систематики відмивання, центрифугування, що ускладнює в мікроміцетів Штам не токсичний, не вірулентний, подальшому одержання меланіну і обумовлює не токсигенний, не швазивний Захищений Патенпідвищення часових і фінансових витрат том України № 1523 від 15 вересня 1993 р Згідно З вказаними аналогами, при одержанні Морфологічна характеристика штаму При мімеланшвмісної біомаси використовуються складні кроскопіюванні культури, що виросла при 25°С середовища, і виникає потреба в дорогих за вартіпротягом 10-14 діб на агаризованих середовищах стю речовинах для їх приготування Недоліками (суслі, середовищі Чапека і картопляновищезазначених аналогів є також те, що викорисглюкозному), гіфи міцелія 1,5 - 4,0мкм товщиною, товуються штами мікроорганізмів, які технологічно СВІТЛООЛИВКОВІ КОНІДІЄНОСЦІ до 400,0 х 3,0 недостатньо придатні і зручні Крім того, за умова4,5мкм, світло-коричневі, гладенькі, на яких утвоми аналогів, в якості посівного матеріалу для одерюються розгалужені ланцюжки КОНІДІЙ КОНІДІЇ ржання біомаси застосовували суспензію клітин переважно ОДНОКЛІТИННІ, овальні, видовженоабо фрагментовании міцелій вихідної культури овальні до майже кулястих, злегка зеленуваті, гладенькі, верхівкові 2,2 - 3,5 х 2,0 - 3,3, серединні Найбільш близьким (прототип) до запропоно6,5 - 11,4 х 3,2 - 3,8 і базальні одно-, ДВОКЛІТИННІ ваного винаходу є спосіб одержання меланінвміс14,0- 16,4хЗ,9мкм ноі біомаси, використовуючи мікроміцет (мікроскопічний гриб) Cladosporium cladosporioides 396 Культуральні властивості штаму Штам росте (Патент України № 1523, Н Н Жданова, А В Мена рідких і агаризованих середовищах пивному лежик, AT Школьный, О И Синявская Получение суслі, середовищі Чапека, картопляно-глюкозному и характеристика меланина гриба Cladosporium Колонії гриба на сусловому агарі через 1 0 - 1 4 діб cladosporioides (Fresen) de Vnes // Микробиол росту в стаціонарних умовах на чашках Петрі дожурн — 1993 — 55, № 1 — С 79 - 84) Штам грисягають 90мм в діаметрі, пухнасті або бархатисті ба має такі переваги є культурою з стійкими і ста(1 - Змм висоти), гладенькі ІНОДІ слабо радіально більними морфолого-культуральними властивосскладчасті, спочатку зеленувато-оливкові потім тями, технологічний, зручний для практичного темнооливкові, з більш пухнастим краєм, 1,0 використання, легко культивується на доступних 1,5мм ширини, на зворотньому боці темносередовищах, тому грибну біомасу можна накопикоричневі до чорних, на агаризованому середовичувати в лабораторних і в промислових умовах щі Чапека колонії ростуть менш інтенсивно, пігментація колоній така ж, на агаризованому картопляМеланінвмісну біомасу гриба вирощували при но-глюкозному середовищі пігментація колоній періодичному глибинному культивуванні на модиштенсивніша фікованому рідкому середовищі Чапека, в якому замість сахарози застосовували харчовий цукор і При культивуванні в стаціонарних умовах на додавали 1% кукурудзяного екстракту Одержану вказаних рідких середовищах гриб утворює повербіомасу ВІДДІЛЯЛИ від культуральної рідини фільтхневу плівку темнооливкового і на картопляноруванням і висушували при 60°С Вихід біомаси глюкозному середовищі - чорного кольору Куль 57317 С cladosponoides 396, який призначений для одетуральна рідина при вирощуванні на середовищі ржання біомаси, готують таким чином Чапека майже не забарвлена 1 Приготування середовища Для одержання В умовах періодичного глибинного культивушокулюму пропонується картопляно-цукрове севання на середовищі Чапека культура гриба утворедовище такого складу рює пелети (кульки міцелію) чорного кольору з темнооливковим ВІДТІНКОМ Культуральна рідина картопляний відвар - 1л, коричнюватого кольору На рідких середовищах з харчовий цукор - 15г, джерелами азотного живлення органічної природи рН середовища - 4,8 - 5,2 і на природних середовищах (крохмаль картопляДля приготування середовища до 150г ретений і кукурудзяний) при 25°С накопичення біомаси льно промитої і очищеної від шкірки нарізаної плаі її пігментація підсилюються стинками картоплі, додають 1л дистильованої води і варять до готовності Картопляний відвар ФІЗІОЛОГІЧНІ властивості штаму Гриб є аероб, фільтрують, доводять до об'єму 1л і додають 15г оптимум росту і спороношення при 25°С, оптимахарчового цукру Одержане картопляно-цукрове льна кислотність поживного середовища 4,8 - 5,2, середовище розливають в ферментаційні колби і не росте при 37°С В процесі росту культури в застерилізують в автоклаві при 0,5атм протягом ЗО лежності від складу поживного середовища кислохвилин тність середовища змінюється до 7,2 - 7,3 Штам гриба проявляє целюлозолітичну, ката2 Приготування суспензії КОНІДІЙ ДО пробірки лазну, глюкозооксидазну ферментативні активносз вихідною культурою гриба додають 15мл стериті і має антиоксидантну властивість, стійкий до льного картопляно-цукрового середовища За довисоких доз УФ- та у-випромінювання, виживає при помогою мікологічної голки конідії і міцелій ретедії високих і низьких температур, в умовах глибольно знімають з поверхні агара, фільтрують через кого вакууму, штучного сонячного світла високої стерильний ватно-марлевий фільтр Одержану інтенсивності суспензію КОНІДІЙ використовують для шокулюма в концентрації 1 млн КОНІДІЙ В 1МЛ середовища Гриб засвоює як джерела вуглецю моносаха3 Вирощування шокулюму Одержану суспенриди (глюкозу, галактозу, фруктозу), олігосахариди зію КОНІДІЙ (Юмл) вносять в колбу ємністю 750мл з (сахарозу, мальтозу, лактозу), сахароспирти, полі200мл картопляно-цукрового середовища і виросахариди (крохмаль картопляний і кукурудзяний), щують на качалці (160об/хвил) при 25°С Через як джерела азоту неорганічні (нітратні, амонійні) і 36 годин росту культура гриба утворює рівномірну органічні форми азоту, добре росте на суслі і кармасу пелет діаметром 1 - 2мл чорного кольору з топляно-глюкозному середовищі Серед органічтемнооливковим ВІДТІНКОМ, які займають біля 1/3 них кислот засвоює лимонну, щавлеву і оцтову об'єму поживного середовища Вирощений інокукислоти люм використовують для подальшого засіву колб Штам гриба в лабораторних умовах зберігаЕрленмейєра і одержання грибної біомаси ється на сусловому агарі, середовищі Чапека та Третій етап картопляно-глюкозному агарі в холодильнику +4 5°С з пересівами через 6 - 8 МІСЯЦІВ І протягом Одержання біомаси штаму в глибинних умобагатьох років - на просі, пшоні, в стерильному вах Інокулюм штаму з розрахунку 5 - 15об % (% грунті та люфілізованому стані від об'єму поживного середовища) використовують для засіву колб Ерленмейєра (ємністю 750мл) Спосіб здійснюється таким чином з 200мл картопляно-цукрового середовища Колби Перший етап розміщують на качалці (200 - 220об/хвил) і шкуВирощування вихідного посівного матеріалу бують при 25°С протягом 4 - 5 діб штаму Для вирощування вихідного посівного маПри одержанні біомаси штама С теріалу штаму, призначеного для одержання іноcladosponoides 396 запропонованим способом кулюму, використовують найбільш поширене сеутворюються пелети, які займають майже весь редовище сусло-агар об'єм культуральної рідини Біомасу фільтрують Вихідною сировиною для приготування серечерез дрібноямчасту нейлонову тканину, ретельно довища є солодове сусло, рН 4,8 - 5,2 Для приговідмивають дистильованою водою від залишків тування суслового агара до 1л рідкого сусла докультуральної рідини Віджату біомасу висушують дають 15 - 20г агар-агара, залишають його на в сушильній шафі при 105°С до постійної ваги і набухання, після чого при постійному перемішуподрібнюють до порошковидного стану за допомованні доводять до кипіння і повного розплавлення гою лабораторного млина з корпусом, стійким до агара Середовище фільтрують, розливають в механічного тертя пробірки і стерилізують при 0,5атм протягом ЗО хв Пробірки з середовищем охолоджують і шкубують При вирощуванні гриба постійно проводять МІпри 28 - 30°С протягом 48 годин для контроля мікКОЛОГІЧНИЙ І бактеріологічний контроль Інфіковані робіологічної чистоти середовища колби відбраковують та видаляють Середовище в пробірках засівають культурою гриба С cladosponoides 396, і засіяні пробірки шкубують при 25°С протягом 10 - 14 діб Одержаний посівний матеріал зберігається при кімнатній температурі протягом 3 - 4-х МІСЯЦІВ, в холодильнику при +4 - 5°С - 6 - 8 МІСЯЦІВ, після чого проводять їх пересів на свіже поживне середовище Другий етап Одержання шокулюму штама Інокулюм штама 8 57317 Таблиця 1 нює КІЛЬКІСТЬ накопичення меланшвмісної біомаси С cladosporioides 396 В порівнянні з прототипом запропоноване картопляно-цукрове середовище є доступне, просте за компонентним складом і значно дешевше, для приготування якого нема потреби в мінеральних речовинах середовища Чапека і кукурудзяному екстракті Переваги засіву поживного середовища, застосовуючи шокулюм, для одержання біомаси штаму С cladosporioides 396 в умовах глибинного культивування наведені в таблицях 2 і З Накопичення меланшвмісної біомаси (г/л) С cladosporioides 396 на запропонованому середовищі Середовище Чапека з 1% кукурудзяного екстракту (прототип) 19,6 ± 1,0 Картопляноцукрове 19,4 ±1,1 Таким чином, дані таблиці свідчать, що запропоноване картопляно-цукрове середовище не зміТаблиця 2 Вихідний ПОСІВНИЙ матеріал КІЛЬКІСТЬ середовища для одержання КІЛЬКІСТЬ, МЛ (або Вид пробірок) Конідії 10 млн КОНІДІЙ/МЛ (прототип) Вегетативний міцелій (прототип) Інокулюм шокулюма, мл (або колб) біомаси, мл (або колб) 10 (одна) не застосовували 200 (одна) 10 (одна) 10 (одна) не застосовували 200 (одна) 200 (одна) 4000 (двадцать) Як свідчать дані таблиці 2, застосування інокулюму для одержання меланшвмісної біомаси С cladosporioides 396 забезпечує засів більшої КІЛЬКОСТІ середовища меншим об'ємом посівного матеріалу, порівнюючи з прототипом Це означає, що для засіву 4000мл середовища використовується всього одна пробірка замість двадцяти з суслоагаром вихідного посівного матеріалу Зміна умов посіву шляхом вирощування шокулюму дає можливість економити КІЛЬКІСТЬ витраченого середовища та лабораторного посуду Таблиця З Середовище Картопляно-цукрове Чапека з 1% кукурудзяного екстракту (прототип) Наведені в таблиці 3 дані свідчать про оптимальне застосування 10об% інокулюма для одержання меланінвмісної біомаси штама С cladosporioides 396 При одержанні грибної біомаси в промислових масштабах це має важливе зна Комп'ютерна верстка А Крулевський 5 12,8 ±0,9 19,6 ± 1,0 КІЛЬКІСТЬ інокулюма, об % 10 19,4 ±1,1 не застосовували 15 19,0 ± 1,3 не застосовували чення для економії посівного матеріалу Крім того, ефект від застосування 10об% інокулюма в картопляно-цукровому середовищі рівнозначно такому в прототипі при застосуванні 1% кукурудзяного екстракту Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна