Живильне середовище для росту штаму м-81 hirschioporus laricinus – продуценту молокозсідного ферменту

Винахід відноситься до біотехнології і може використовуватися у ферментативній технології для одержання ферменту молокозсідної дії на основі культивування нового продуценту - штама М-81 Hirschioporus laricinus [1]. Цей фермент може вживатися у виробництві сирів та стати замінником гостродефіцитного сичужного ферменту - реніну, Відомі середовища, які містять сахарозу та мінеральні компоненти (середовище Білай, Вельтьє та Хеннеберга), глюкозу та мінеральні компоненти (середовище Чапека-Докса) [3], [4], але активність молокозсідного ферменту гриба Hlrschloporus lariclnus, який зростав на цих середовищах, досить низька та на 10-ту добу культивування зникає. Найбільш близьким за ціллю до заявленого об'єкту є глюкозо-пептонне середовище за таким складом, г/л: глюкоза - 18-20, пептон - 8-Ю, КН2РО4 - 0,6, К2НРО4 - 0,4, MgSO4 -7H2O - 0,9, СаСІ 2 - 0,11-0,13, NaCl -0,180,20, ZnSO4 -7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л [2]. Це середовище забезпечує утворення молокозсідного ферменту Hirschioporus lariclnus протягом всього періоду його культивування, але ці компоненти досить дорого коштують та не забезпечують одержання високих значень біомаси штаму М-81, що свідчить про недостатнє забезпечення продуценту необхідними живильними компонентами для його росту. В основу винаходу поставлена задача - удосконалення живильного середовища для росту штама М-81 Н. laricinus - продуценту молокозсідного ферменту, у якому досягнення високих значень молокозсідної активності та виходу протеаз молокозсідної дії, а також біомаси, при поверхневому культивуванні, досягається шляхом використання більш дешевших, за доведеними, компонентів живильного середовища, які є відходами молочного та пивоваренного виробництва. Поставлена задача вирішується тим, що у живильному середовищі для росту штама М-81 Н. laricinus продуценту молокозсідного ферменту, яке має вуглець - та азотмістні компоненти використовуються, відповідно винаходу, молочна сироватка та пивне сусло за таким співвідношенням компонентів: молочна сироватка - 350-400 мл, пивне сусло - 300-330 мл, дистильована вода - решта. Удосконалення живильного середовища проводили за метолом повного факторного експерименту 52 (ПФЕ 52) [5]. Такі експерименти дають можливість виявити найбільш ефективний вплив кожного окремого фактору та їх взаємозв'язку на біосинтез протеїназ молокозсідної дії та накопичення біомаси штамом М-81 Н. laricinus. Живильне середовище готують шляхом змішування його компонентів з послідуючим доведенням дистильованою водою до 1 л. Кислотність середовища доводять до 4,3-4,5 рН за допомогою 10%-ного НСІ. Живильне середовище розливають по 50 мл у конічні ковби на 250 мл та стерилізують у автоклаві при 0,8-1,0 атм протягом 40 хв. Гриб вирощують протягом 10-ти діб при температурі 30-31 °С. Молокозсідну активність культурального фільтрату визначають за методом Каваїта Мукаї [7], а розрахунок ведуть за формулою [6]: де К - коефіцієнт розведення культурального фільтрату (КФ); Π - час здвурдження молока, хв; 40 - середній час здвурдження молока при виробництві сирів. Приклад 1. Готують вихідне середовище за таким складом, г/л: глюкоза -18-20, пептон - 8-10, КН2РО4-0,6, К2НРО4-0,4, MgSO4 ·7Η2O - 0,9-1,1, СаСІ 2 - 0,1 ΙΟ, 13, NaCI - 0,18-0,20, ZnSO4 - 0,001, дистильована вода до 1 л. Живильне середовище розливають по 50 мл у конічні ковби та стерилізують в автоклаві протягом 40 хв при 0,8-1,0 атм. Кислотність середовища після стерилізації становила 4,4 рН. Після охолодження середовище Інокулюють шматочком міцелію розміром 10x10 мм. Вирощують продуцент при температурі 30-31°С протягом 10 діб та визначають молокозсідну активність культурального фільтрату, кількість ферменту та накопичення біомаси. Активність культуральної рідини дорівнює 85 106 ум. од./100 мл молока, вихід ферменту становить 234 мг/л, біомаси міцелію - 1874 мг/л. Приклад 2. Готують живильне середовище за таким складом: молочна сироватка 450 мл, пивне сусло 200 мл, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню середовища такі, як у прикладі 1. Молокозсідна активність культуральної рідини дорівнює 25 263 ум.од./100 мл молока, вихід ферменту становить Τ15 мг/л, біомаси міцелію - 3 243 мг/л. Приклад 3. Готують живильне середовище за таким складом: молочна сироватка 150 мл, пивне сусло 300 мл, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню середовища такі, як у прикладі 1. Молокозсідна активність культуральноТ рідини дорівнює 24 000 ум.од./100 мл молока, вихід ферменту становить 155 мг/л, біомаси міцелію - 2 632 мг/л. Приклад 4. Готують живильне середовище за таким складом: молочна сироватка 600 мл, пивне сусло 100 мл, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню середовища такі, як у прикладі 1. Молокозсідну активність культуральної рідини протягом 40 хв не визначено, вихід ферменту незначний, біомаса міцелію дорівнює 920 мг/л. Приклад 5. Готують живильне середовище за таким складом: молочна сироватка 350-400 мл, пивне сусло 100-130 мл, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню середовища такі, як у прикладі 1. Молокозсідна активність культуральної рідини дорівнює 48 000 ум.од./100 мл молока, вихід ферменту становить 372 мг/л, біомаса міцелію - 12 235 мг/л. Пропоновані компоненти можна використовувати в означених межах, тому що це значно не відбивається на активності та кількості ферменту та біомаси. Таким чином удосконалене середовище молочна сироватка - пивне сусло, яке має у своєму складі молочну сироватку 350-400 мл, пивне сусло 300-330 мл та дистильовану воду до 1 л, може використовуватися для зросту штама М-81 Hirschloporus larlclnus з метою одержання молокозсідного ферменту. Це середовище дає можливість одержати ферментного препарату у 1,5 разів, біомаси у 6,5 разів більше ніж вихідне. Крім того його компоненти дешевше за компонентами глюкозо-пептонного середовища і є відходами молочного та пивовареного виробництва.