Штам vibrio cholerae o1 № 33-д для контролю ростових властивостей поживних середовищ при діагностиці холерних вібріонів

Штам Vibrio cholerae О1 №33-Д, задепонований 27.11.2008p. під номером 37-Д в депозитарії музею патогенних для людини мікроорганізмів (МПМ) ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського" АМН України, який знаходиться у колекції філії МПМ на базі Державного закладу "Українська протичумна станція" Міністерства охорони здоров'я України, для контролю ростових властивостей поживних середовищ при діагностиці холерних вібріонів. Корисна модель належить до медицини, а саме, до бактеріології, і може використовуватися в практичних та наукових лабораторіях, референслабораторії МОЗ України з діагностики холерних та інших патогенних вібріонів, з метою контролю ростових властивостей поживних середовищ і вхідного контролю діагностичних препаратів для діагностики холери. До цього часу, як референтну, використовували культуру Vibrio сholerae О1 Р1, яку одержали в 1985р. з Науково-дослідного протичумного інституту «Микроб» м.Саратов [1]. Культура дисоціювала і не може використовуватись, як референтна, отже штам потребує поновлення. Цей штам виділений та зареєстрований за кордоном, його придбання та періодичні поновлення мають високу вартість, це пов'язане зі складною процедурою придбання патогенних вірулентних бактерій. В основу корисної моделі поставлене завдання знайти новий штам, який може бути використаний для діагностики холерних та інших патогенних вібріонів, контролю якості поживних середовищ і вхідного контролю діагностичних препаратів при дослідженнях на холеру. Штам має бути доступний на території України та відповідно мати нижчу вартість, ніж при придбанні у закордонних колекціях. Поставлене завдання вирішують за рахунок застосування вперше саме штаму Vibrio сholerae О1 №33-Д для контролю якості поживних середовищ і вхідного контролю діагностичних препаратів при дослідженнях на холеру. Штам Vibrio сholerae O1 №, задепонований 27.11.2008р. під номером 33-Д у колекції депозитарію музею патогенних для людини мікроорганізмів (МПМ) Державної установи «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського» Академії медичних наук України. Штам знаходиться у філії МІГМ базі Державного закладу «Українська протичумна станція» Міністерства охорони здоров'я України. Штам має характерні властивості. Морфологічні ознаки. У мазках з добових агарових культур клітини цього штаму мають вигляд вигнутих грамнегатив (19) UA (11) 57567 (13) (21) u201007163 (22) 09.06.2010 (24) 10.03.2011 (46) 10.03.2011, Бюл.№ 5, 2011 р. (72) ХАЙТОВИЧ ОЛЕКСАНДР БОРИСОВИЧ, ІЛЬЇЧЬОВ ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ПІДЧЕНКО НАДІЯ НИКИФОРІВНА, В'ЯЛИХ ЖАННА ЕДУАРДІВНА (73) ДЕРЖАВНИЙ ЗАКЛАД "УКРАЇНСЬКА ПРОТИЧУМНА СТАНЦІЯ" МОЗ УКРАЇНИ, ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕ U 1 3 57567 них паличок, що рухаються. Спор і капсул не утворюють, добре фарбуються всіма аніліновими барвниками. Поліморфізм помірно виражений. Культуральні властивості. На пластинах 1,5-2% лужного агару рН (7,6±0,2) вібріони штаму Vibrio сholerae О1 №33-Д виростають у вигляді круглих ніжних, напівпрозорих, блакитних у проточному світлі колоній розміром 1,5-2мм у діаметрі. Колонії на твердому елективному середовищі Т8В8 мають яскраво-жовтий колір на зеленому фоні середовища, напівпрозорі, 1,5-2мм у діаметрі. Добре ростуть на елективному середовищі Vibrio агар у вигляді круглих, напівпрозорих, блакитних у проточному світлі колоній, розміром 1,52мм у діаметрі. У бульйоні і лептонній воді вібріони у процесі росту дають рівномірне помутніння й утворюють поверхневу плівку. Після 3-х днів зберігання посівів при кімнатній температурі морфологія колоній зберігається. Суспензії добових агарових культур у 0,9% розчині NаСl стабільні і не аглютинуються у розчині трипофлавіну. Оптимальна температура росту (37+1)°С, температурний інтервал росту 20-40°С, час росту 1820 годин. Біохімічні ознаки. Вібріони штаму Vibrio сholerae О1 №33-Д володіють оксидазною активністю. Ферментують глюкозу в середовищі Хью-Лейфсона в аеробних й анаеробних умовах, ферментують манніт, сахарозу, манозу, але не розщеплюють лактозу, арабінозу, інозит, мають ферменти діастазу, желатиназу та триптофаназу (індол). Фермент тіосульфатредуктази (сірководень) - негативний. Ріст на 1% лептонній воді з 0% КаСІ - присутній, на 1% лептонній воді з 7% NаСl - відсутній, на 1% лептонній воді з 10% КаСl - відсутній. Містять декарбоксілазу лізину і орнітину, але не мають дигідролази аргініну. Антигенні властивості. Штам Vibrio сholerae О1 №33-Д відноситься до серогрупи О1, має типову реакцію аглютинації з холерними сироватками: холерна сироватка О1:3200 ++++, сироватка Огава 1:800 ++++; сирова 4 тками Інаба, RО, O139 вібріони цього штаму не аглютинуються. Реакція з холерними флуоресцентними антитілами ++++. Чутливість до фагів: холерного - негативна, ельтор 10-3 +++, ХДФ-3 10-3 +++, ХДФ-4 - негативна, ХДФ-5 10-3 +++, ДДФ негативна. Гемолітична активність по Грейгу - негативна. Реакція гемаглютинації ++++. Культура була досліджена за допомогою полімеразної ланцюгової реакції на наявність наступних генів: ген tохR (ген видової належності культури, глобальний ген регулятор), Нlу - для визначення виду всіх серогруп Vibrio сholerae; Wbet - для визначення належності до серогрупи О1; Wbet - для визначення належності до серогрупи 0139; сіх (токс-ген) -для виявлення холерного токсину (холерогену), іср (токсин-корегулюючих пілей адгезії) - для виявлення здатності адгезії збудника холери. У культури виявлені гени toxR, Нlу, WbеТ, сtх, tср, ген WbеF відсутній. Штам зберігається у ліофілізованому стані при температурі +4-6°С, життєздатність його зберігається не більше 5 років, або в напіврідкому 0,4% поживному агарі (рН 7,6-7,8) під шаром стерильної вазелінової олії при температурі +18 - +25°С, але не більше 1 року. Приклад 1. Здійснення корисної моделі. При висівах на середовища збагачення - 1% пептонну воду та бульйон Хоттінгера культури V. сholerae О1 №225 через 6 годин росли у вигляді рівномірного помутніння з ніжною плівкою на поверхні. Була відсутня дисоціація колоній при зберіганні протягом 48-72 годин на лужному агарі при t=20(±2)°С. Не виявлено S-R-дисоціації у культур в тесті з фізіологічним розчином та RО-сироваткою. Морфологія мікробних клітин у всіх досліджуваних культур була типова - Грам негативні вигнуті палички. За характером росту на лужному агарі - блакитні, круглі, напівпрозорі колонії з рівним краєм до 2мм у діаметрі. На рідкому середовищі збагачення ріст у всіх культур спостерігався у вигляді рівномірного помутніння з утворенням плівки на поверхні. Біохімічні, серологічні властивості культур та результати досліджень з фагами після 5 пасажувань на лужному агарі наведені в табл.1. Таблиця1 Визначення ефективності корисної моделі ОЗНАКИ 1 Лактози Маніту Сахарози ФЕРМЕНТАЦІЯ: Манози Арабінози Інозиту Середовище Кодама 1 пасаж V. Сholerae O1 33-Д 2 негативна кислота кислота кислота негативна негативна позитивна 2 пасаж V. Сholerae O1 33-Д 3 негативна кислота кислота кислота негативна негативна позитивна 3 пасаж V. Сholerae O1 33-Д 4 негативна кислота кислота кислота негативна негативна позитивна 4 пасаж V. Сholerae О1 33-Д 5 негативна кислота кислота кислота негативна негативна позитивна 5 пасаж V. Сholerae О1 33-Д 6 негативна кислота кислота кислота негативна негативна позитивна 5 57567 6 Продовження таблиці 1 Середовище Хью-Лейфсона (окислення глюкози) кислота кислота кислота кислота кислота Середовище Хью-Лейфсона (ферментація глюкози) кислота кислота кислота кислота кислота УТВОРЕННЯ: Індолу позитивна позитивна позитивна позитивна позитивна Н25 позитивна позитивна позитивна позитивна позитивна желатина позитивна позитивна позитивна позитивна позитивна Реакція Фогес-Проскауера позитивна позитивна позитивна позитивна позитивна Ріст на 1% пептонній воді без NаСІ ріст ріст ріст ріст ріст Ріст на 1% пептонній воді з 7% NаСІ немає росту немає росту немає росту немає росту немає росту Ріст на 1% пептонній воді з 10% МаСІ немає росту немає росту немає росту немає росту немає росту Лізиндекарбоксілаза позитивна позитивна позитивна позитивна позитивна Аргішндигідролаза негативна негативна негативна негативна негативна Орнітиндекарбоксілаза позитивна позитивна позитивна позитивна позитивна Контроль амінокислот норма норма норма норма норма АГЛЮТИНАЦІЯ 1:3200 1:3200 1:3200 1:3200 1:3200 Сироватка «O» ++++ ++++ ++++ ++++ +++ Сироватка «RО» негативна негативна негативна негативна негативна Сироватка Інаба негативна негативна негативна негативна негативна Сироватка Огава 1:800+-Н-+ 1:800+-Н-+ 1:800++++ 1:800+-Н-+ 1:800++++ Сироватка 0139 негативна негативна негативна негативна негативна Холерний фат цільний цільний цільний цільний цільний «С» + + + + + Холерний фат Еltor 10-3 +++ 10-3 +++ 10-3 +++ 10-3 +++ 10-3 +++ Фаг ХДФ - 3 10-3 ++ 10-3 ++ 10-3 ++ 10-3 ++ 10-3 ++ Фаг ХДФ - 4 негативна негативна негативна негативна негативна Фаг ХДФ - 5 10-3 ++ 10-3 ++ 10-3 ++ 10-3 ++ 10-3 ++ Фаг ДДФ +++ +++ +++ +++ +++ Наявність гену tохR присутній присутній присутній присутній присутній Наявність гену Нlу присутній присутній присутній присутній присутній Наявність гену сtх присутній присутній присутній присутній присутній Наявність гену tср присутній присутній присутній присутній присутній Наявність гену WbeT присутній присутній присутній присутній присутній Наявність гену WbeF відсутній відсутній відсутній відсутній відсутній Із таблиці видно, що тривале пасажування на лужному агарі не впливає на характерні ознаки Vibrio сholerae O1 №33-Д, цей штам можливо успішно застосовувати для контролю ростових властивостей поживних середовищ для діагностики холерних вібріонів, вхідного контролю діагностичних препаратів при дослідженнях на холеру. Приклад 2. Порівнювали ростові властивості на твердих поживних середовищах референтних культур V. сholerae 01 Р-1 та запропонованої V. сholerae O1 225, дані представлені в табл.2, 3. Таблиця 2 Паралельні дослідження поживного середовища основного пептону референтними культурами V. сholerae O1 Р-1 та запропонованою V. сholerae О1 33-Д № серії основного пептону 1 3 4 6 8 10 12 17 Контрольна серія V. сholerae O1 Р-1 10 клітин 100 клітин Кількість Кількість d мм d мм колоній колоній 4 2-3 40 2-3 1 2-3 10 2-3 1 2-3 10 2-3 1 2-3 10 2-3 1 2-3 10 2-3 1 2-3 10 2-3 1 2-3 10 2-3 1 2-3 10 2-3 3 2-3 30 2-3 V. сholerae O1 33-Д 10 клітин 100 клітин Кількість Кількість d мм d мм колоній колоній 5 2-3 50 2-3 2 2-3 20 2-3 3 2-3 30 2-3 3 2-3 30 2-3 3 2-3 30 2-3 3 2-3 30 2-3 6 2-3 60 2-3 4 2-3 40 2-3 4 2-3 40 2-3 7 57567 8 Таблиця 3 Паралельні дослідження поживного середовища лужного агару референтними культурами V. сholerae O1 Р-1 та запропонованою V. сholerae O1 33-Д № серії лужного агару 1 2 3 4 5 6 34 Контрольна серія V. сholerae O1 Р-1 10 клітин 100 клітин Кількість Кількість d мм d мм колоній колоній 2 2-3 26 2-3 2 2-3 27 2-3 2 2-3 23 2-3 1,5 2-3 30 2-3 2 2-3 24 2-3 2 2-3 29 2-3 1,5 2-3 25 2-3 2 2-3 25 2-3 Висновок: Штам УіЬгіо сЬоіегае О1 №33-Д доступний в Україні, стабільні морфологічні, культуральні, біохімічні, серологічні характеристики штаму Vibrio сholerae O1 №33-Д дозволяють використовувати його для діагностики холерних та інших патогенних вібріонів, контролю якості поживних середовищ і вхідного контролю діагностичних препаратів при дослідженнях на холеру. Наявність штаму Vibrio сholerae O1 №33-Д у вітчизняній ко Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко V. сholerae O1 33-Д 10 клітин 100 клітин Кількість Кількість d мм d мм колоній колоній 6 2-3 47 2-3 6 2-3 40 2-3 5 2-3 46 2-3 6 2-3 43 2-3 2 2-3 45 2-3 4 2-3 45 2-3 4 2-3 45 2-3 5 2-3 50 2-3 лекції дозволить уникнути витрат коштів на купівлю штамів у закордонних колекціях та на періодичне поновлення цих штамів. Джерела інформації: 1. „Інструкція з організації та проведення протихолерних заходів, клініка та лабораторна діагностика холери", затверджено наказом МОЗ України №167 від 30.05.1997року. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601