Спосіб приготування аутовакцини

Спосіб одержання аутовакцини, що передбачає відбір біологічного зразка, культивацію, накопичення та ідентифікацію збудника, інактивацію матеріалу для імунізації, контроль сте рильності і введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин, який відрізняється тим, що відібраний біологічний зразок розділяють на 2 частки, після чого з першо» частки зразку готують суспензію антигену, для чого у відібраному зразку вилучають сторонню міхрофлору, культивують і накопичують збудник в епітеліальних клітинах та ідентифікують його методом полімеразиої ланцюгової реакції, а з другої частки виділяють ДНК або РНК збудника і накопичують та ідентифікують його також методом полімеразної ланцюгової реакції, з наступним змішуванням суспензії антигену і ДНК або РНК збудника, при співвідношенні ДНК або РНК збудника і суспензії антигену збудника, рівному 1:(100-1000). Винахід відноситься до медицинської промисловості, зокрема до технології одержання вакцини, яка використовується для лікування хворих з різними ураженнями органів і систем, які викликані вірусами, бактеріями і їх асоціаціями з іншими збудниками. Відомо, що очищена молекула антигену є вакциною. Введення антигену вакцини забезпечує синтез антитіл. Молекула ДНК або РНК також є вакциною. її введення забезпечує синтез чужорідних протеїнів клітинами вакцинуємого організму, що призводить до продукування антитіл. Виробка антитіл сприяє підвищенню імунітету проти відповідного збудника. Найближчим до заявляемого є спосіб приготування аутовакцини по методу Горпєва Г.Б. (див. Горгиев Г.Б. О приготовлении аутовакцины с применением бактерицидных факторов рыбьего жира. - Ж. Лабораторное дело, 1960, Ne 1, С. 43). Одержану таким чином бактерицидну рідину піддають інкубації у термостаті при 37°С протягом 2-3 днів і контролюють стерильність. Для цього аутовакцину висівають на цукровий бульон і агар. Результати перевіряють на 3-4 день Суспензію аутовакцини вводять у фізіологічний розчин. Приготовлену таким чином аутовакцину зберігають при 4-6°С. Аутовакцина залишається стерильною протягом 6 місяців. Даний спосіб обрано прототипом. Прототип співпадає з винаходом, що заявляється, у наявності спільних ознак: - відбір біологічного зразку; - накопичення збудника; - ідентифікація збудника; - інактивація матерзалу для імунізації; - контроль стерильності; - введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин. Але способом по прототипу одержують аутовакцину, за допомогою якої можна лікувати захворювання, збудником яких є мікроорганізми роду Staphyiococcus, що дуже обмежує функціональні можливості способу. В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб приготування аутовакцини, в якій, за рахунок одержання з одного біологічного зразка суспензії антигену збудника і ДНК або РНК збудника, заміни методу ідентифікації збудника та змі У відповідності з відомим способом у людини відбирають біологічний матеріал (аутоштам) і висівають його на агар. Добову культуру після перегляду мазків змивають фізіологічним розчином і зливають у 2 пробірки. У першій пробірці бактеріальну суспензію доводять до заданої концентрації' (1 млрд. мікробних тіл), а у другій пробірці необхідний титр одержують шляхом додавання такої ж кількості бактерицидної рідини. < Э а» 39701 шування ДНК або РИК збудника та суспензії його антигену забезпечити одержання моноваленгної та полівалентної аутовакцин придатних для ткування захворювань, які викликані вірусами паразитичним грибами, бактеріями та їх асоціаціями з найпростішими класу джгутикових Поставлена задача вирішена у способі приготування аутовакцини що передбачає відбір біологічного зразка, культивацію, накопичення та ідентифікацію збудника, інактивацію матеріалу для імунізацн контроль стерильності, і введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин тим, що відібраний біологічний зразок розділяють на 2 частки, після чого з першої частки зразку готують суспензію антигену, для чого у відібраному зразку вилучають сторонню мікрофлору, культивують і накопичують збудник в епітеліальних клітинах та ідентифікують його методой» лслі^ерагно. ланцю гової рєакцн (ПЛР), а з друга* частки виділяють ДНК або РНК збудника \ накопичують та ідентифікують його також методом полімеразної ланцюгової реакції, з наступним змішуванням суспензії антигену і ДНК abo PHK збудника, при співвідношенні ДНК або РНК збудника і суспенз» антигену збудника рівному 1 (100 1000) Причинно-наслщковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, і досягнутим результатом можна пояснити слідуючим Сторонню мікрофлору вилучають з відібраного зразку для того, шоб вона не імогяа помішати ідентифікації збудника, або привезти до неточних результатів Крім того, будь-який чужорідний білок при введенні в організм викликає появу алерпчних реакцій Для зведення їх до мінімуму з препарату треба вилучити усі сторонні домішки, крім самих епітеліальних клітин пацієнта, в яких розмножується збудник зокрема хламідн Необхідність культивування збудника в епітеліальних клітинах зразка пояснюється слідуючим Для ефективного впливу аутовакцини необхідна достатня КІЛЬКІСТЬ матеріалу для імунізації тобто антигену збудника, зокрема хламідій Таку КІЛЬКІСТЬ можна накопичити тільки шляхом культивування, тобто розмноження збудника Виходячи з того що хламіди - це внутрішньоклітинні паразити, їх культивування ЗДІЙСНЮЮТЬ не на поживних середовищах, а в культурах клітин Але цей процес потребує наявності культур клітин, спеціального обладнання, реактивів, він досить тривалий {3-5 діб) І багато коштує Запропонована операція культивування збудника, зокрема хламщій, у власних епітеліальних клітинах пацієнта, які присутні в біологічному зразку, за своею ефєктивнгстю не посту лається огисаному відомому способу але значно дешевше, швидше ( протягом 1 -і доби), не потребує спеціального обладнання і реактивів Крім того, культивування збудника у власних клітинах дозволяє уникнути занесення чужорідних білків і, за рахунок цього, уникнути появи у пацієнта алергічних реакцій на введення аутовакцини Ц© значно підвищує якість препарату ДОЦІЛЬНІСТЬ застосування метода полімеразноі ланцюгово» рєакцн для ідентифшації збудника ПОЙСИЮЄТЬГ я слідуючим Для ідентифікації збудника, зокрема хламідій, у соскобному матеріалі необхідно збільшити КІЛЬКІСТЬ збудників, як« знаходяться у зразку для наступного їх виявлення Але, як показано вище, культивування хламідій в культурі клітин має ряд недоліків Крім того після культивування треба проводити сам процес ідентифікації (мікроскопія, імунологічні реакції тощо) Використання методу полімеразної ланцюгової реакції дозволяє - значно (у 3-5 разів) скоротити витрати праці та часу - цю роботу можна виконати протягом 1 робочого дня, - значно підвищити точність ідентифікації збудника, - спростити процес за рахунок зменшення кількості операцій Використання мікрокількостт ДНК або РИК збудника забезпечує більш сильну імунну ВІДПОВІДЬ НІЖ при використанні значно більшої (у 100-1000 разів) КІЛЬКОСТІ вірусних і бактеріальних білк.в Крім того, ДНК'РНК аутовакцину простіше і швидше виготовляти її стабільність краще ніж ау товакцини по прототипу А головне це те, що таким способом можна приготувати аутовакцини які придатні для лікування широкого спектру хвороб, тому, що крім антитіл, у відповідь на їх введення виробляються ще й клітини-кілери (1 -цито токсичні лімфоцити) як» вбивають заражені клітини людини і не дають таким чином espycy, бактеріям розмно жуватися Аутовакцина на основі ДНК « РНК не є небезпечною для пацієнта, тому що ДНК і РИК не інфекційний матеріал Аутовакцина, яка приготовлена шляхом змішування суспензії антигену збудника і ДНК або РЧК, збудника дозволяє значно підвищити ефективність лікування захворювань, ям викликане збудниками вірусної, бактеріальної, МІКОТИЧНОІ етіології та їх асоціаціями з іншими збудьикамш, тому, що при її введенні виробляються у перш/ чергу чужорідні антигени, у відповідь на введення ДНК або РИК збудника, а потім спостерігається продукування антитіл проти ВІДПОВІДНОГО збудникч, що покращує стам імунітету хворого » сприяє успішному лікуванню Співвідношення ДНК або РНК збудника «суспензії антигену підібрано експериментально При співвідношенні ДНК або РИК збудника і суспензії антигену збудника менш ніж 1 100 (наприклад, 1 75) спостерігається надлишок нукле1нових кислот збудника, що веде до надто активної імунної відповіді і може поизвести до розвитку алерпчних реакцій Збільшення співвідношення ДНК або РИК збудника і суспензії антигену збудника (наприклад, 1 1500) веде до недостатнього продукування антигенів збудника в організм» хворого, що зменшує імунну відповідь організму хворого, зокрема зменшує продукування Т-цитотоксичних клітин (кілерів) і антитіл проти збудника Аутовакцину готують слідуючим чином У хворого відбирають біологічний зразок, наприклад зскрібо* Відібраний зразок розділяють на дв» (примірно однакові) частини Перша частина зража призначена для одержання з нього суспензії антигену збудника, а друга частина для одержання ДНК або РНК збудника Спочатку у першій частині біологічного зразка вилучають сторонню мікрофлору, культивують \ накопичують збудник в епітеліальних клітиьах зразка Після ЦЬОГО ЗДІЙСНЮЮТЬ ідентифікацію 39701 збудника методом ПЛР Отриманий таким чином матеріал для імунізації піддають інактивації, перевіряють стерильність і вміщують у стерильний посуд З другої частини біологічного зразка виділяють ДНК або РНК збудника і методом ПЛР накопичують та ідентифікують збудник, інактивують його, перевіряють стерильність і вміщують у стерильний посуд. Отриманий таким чином розчин ДНК або РНК збудника і суспензію антигену збуднику змішують при співвідношенні 1: (100 - 1000) відповідно, а суміш вводять у фізіологічний розчин та вміщують у стерильний посуд (ампули). Ампули з готовою аутовакциною запаюють і зберігають при 4-5°С протягом 6 місяців. Приклад приготування аутовакцини С Ігзспоmatis1 У пацієнта, хворого на хронічний простатит ложкою Фолькмана зробили зскрібок зі слизової уретри Відібраний зразок поділили на 2 частки D першій частині зразка вилучали сторонню мікрофлору, для чого відібраний зразок вміщували у флакони, хожен з яких містить по 3 мл охолодженого транспортного середовища з антибіотиками (поживне середовище 199 з 5%-ю сироваткою рогато* худоби і 2 мкг/мл гентаміцину) Після цього проводили культивацію та накопичення збудника у власних епітеліальних клітинах. Для цього флакони вмістили у холодильник і витримували при +4°С протягом 3 годин Після цього флакони вмістили у термостат на 48 годин при 36°С. Дослідний зразок центрифугували при 2500 g 10 хвилин Для ідентифікації відбирали частку зразку і переміщували ft у пробірку типу Єплендорф 3 відібраного таким чином зразку виділяли ДНК В пробірку об'ємом 1,5 мп внесли 100 мкл аналізуємо» проби, додали 400 мкл пізуючого реагента, наприклад, 1 М розчину гідроксиду натрію, перемішали і вмістили в термостат при 65°С на 30 хаилин До одержаного таким чином супернатанта додали 20 мкл суспензії сорбенту (фзрма "Бюком"). Після ретельного перемішування додавали 800 мкл сольового буферу і знову інтенсивно перемішували. Після цього центрифугували протягом 10 сек, при 5000 g і вилучили супернатант. До осаду додавали 1 мл сольового буферу і повторно центрифугували 10 сех при 10000 д. супернатант вилучали, а осад підсушували при 65°С 1,5 хвилин. У пробірку додавали 100 мл елюіруючого буферу і одержували гомогенну суспензію. Операцію суспензирування проводили двічі, після чого супернатант переносили в стерильну пробірку і зберігали зразки ДНК збудника при - 20°С. Після цього проводили ідентифікацію ДНК збудника у два етапи Спочатку приготували суміш для ампліфікації. В необхідну кількість пробірок вносили по 2 мкл буферу для ампліфікації, 1 мкл прямого та зворотнього праймерів, 2 мкл розчину дезоксинуклеозідтрифосфатів, 1 мкл термостабільної ДНКполімерази Taq, після чого доводили загальний об'єм рідини до 25 мкл стерильною деіонізованою водою До готового розчину додавали до 20 мкл мінеральної олії, щоб запобігти випаровуванню і зберегти стабільність об'єму розчину. В пробірки для негативного контролю, які маркіровані "-", вносили по 15 мкл негативного контрольного зразка. 8 пробірки для зразків, що підлягають аналізу вносили по 15 мкл ДНК збудника В пробірки для позитивного контролю, які маркіровані "+", вносили 15 мкл позитивного контрольного зразка Після введення зразків ДНК збудника утворюється стійка трифазна система, поділена мінеральною олією на верхню і нижню фази. Пробірки установлювали у термостат і нагрівали до 65 С, при цьому генеральна олія розтоплювалася і підіймалася уверх, а верхня і нижня фази перемішувалися. Після цього проводили ампліфікацію багатократне збільшення числа копій специфічної ділянки ДНК, каталізуємої ферментом ДНК-полімеразою (Taq-попімераза) з термофільних бактерій Thermis aguaticus по програмі: спочатку 1 хвилину при 95°С, 1 хв. при 64°С, 1 хв. при 72°С -один цикл, ЗО сек при 95 в С, ЗО сек при 64°С, ЗО сек при 72Х- ЗО циклів, 2 хв. при 72°С - один цикл, після чого зразки охолоджували до +4"С і зберігали при даній температурі. Для подальшої ідентифікації відібрали дослідний зразок в об'ємі 5мкл і проводили електрофорез Спочатку приготували робочий розчин ТВЕбуфєра для електрофорезу. Після готували 1,7%-й агарозний гель, вміщували його в конічну колбу і додавали 15 мкл броміда етідію, обережно перемішуючи Розтоплену агарозу охолоджували до 50"С і заливали на платформу з фебінкою товщиною шара ~ 4 мм. Після застигання обережно виймали гребінку, а платформу переносили в електрофоретичну камеру і заливали 800 мл буфер ТВЕ так, щоб він укривав гель шаром - 3-4 кш. Далі 15 мкл продукту ампліфікації змішували з 5 мил барвника (бромфечоловий синій). Далі камеру накривали кришкою і вмикали на 25 хв. Після сеансу електрофорезу агарозний гель клали на екран УФ-трансілюмінатора, вмикали його і обраховували отримані результати. Проба з пробірки з позитивним контролем, яка маркірована "+", повинна дати одну смугу, яка світиться жовтим кольором, a s пробі з негативним контролем, яка маркірована "-", такої полоси не повинно бути. Наявність смуги, яка світиться жовтим кольором підтверджує про позитивну реакцію зразка на наявиіегь ДНК C.trachomatis. Інактивацію C.trachomatis проводили кип'ятінням протягом 5 хв. при 100"С Після інактивації проводили контроль на стерильність, висіваючи суспензію клітин на м'ясопептонний агар, живильний бульон і середовище Сабуро. На 3-й день перевіряли посів Проростання не було відмічено. Отриману таким чином аутовакцину стерильним шприцем залили в стерильні ампули. ПІСЛЯ ЦЬОГО З другої частики приготували вакцину з ДНК збудника. Для цього спочатку з дослідного зразка виділили ДНК. З відібраного та«сим чином зразку виділяли ДНК. В пробірку об'ємом 1,5 мл внесли 100 мкл аналізуємо'! проби, додали 400 мкл лізуючого реагента, наприклад, 1 М розчину гідроксиду натрію, перемішали і вмістили в термостат при 65°С на ЗО хвилин. До одержаного таким чином супернатанта 39701 додали 20 мкл суспензії сорбенту (фірма "Біоком"). Після ретельного перемішування додавали 800 мкл сольового буферу і знову інтенсивно перемішували. Після цього центрифугували протягом 10 сек, при 5000 g і вилучили супернатанг. До осаду додавали 1 мл сольового буфера і повторно центрифугували 10 сек при 10000 д, супернатант вилучали, а осад підсушували при 65"С 1,5 хвилин. У пробірку додавали 100 мл елюїруючого буферу і одержували гомогенну суспензію. Операцію суспензирування проводили двічі, після чого супернатант переносили в стерильну пробірку і зберігали зразки ДНК збудника при - 20°С. Після цього проводили накопичення та ідентифікацію ДНК збудника у два етапи. Спочатку приготували суміш для ампліфікації. В необхідну кількість пробірок вносили по 2 мкл буферу для ампліфікації, 1 мкл прямого та зворотнього праймерів, 2 мкл розчину дезоксинуклеозідтрифосфатів, 1 мкл термостабільної ДНКполімерази Taq, після чого доводили загальний об'єм рідини до 25 мкл стерильною деіонізованою водою. До готового розчину додавали до 20 мкл мінеральної олії, щоб запобігти випаровуванню і зберегти стабільність об'єму розчину, В пробірки для негативного контролю, які маркіровані "-", вносили по 15 мкл негативного контрольного зразка. В пробірки для зразків, що підлягають аналізу, вносили по 15 мкл ДНК збудника В пробірки для позитивного контролю, які маркіровані "••", вносили 15 мкл позитивного контрольного зразка. Після введення зразків ДНК збудника утворюється стійка трифазна система, поділена мінеральною олією на верхню і нижню фази. Пробірки устаноэлювали у термостат і нагрівали до 65°С, при цьому мінеральна ОПІЙ розтоплювалася і підіймалася уверх, а верхня і нижня фази перемішувалися. Після цього проводили ампліфікацію - багатократне збільшення числа копій специфічної ділянки ДНК, каталізуємої ферментом ДНК-полімеразою (Taq-полімераза) з термофільних бактерій Thermis aguaticus по програмі: спочатку 1 хвилину при 9 5 Х , 1 хв. при 64°С, 1 хв. при 72°С -один циіш; ЗО сек при 95°С, 30 сек при 64°С, ЗО сек при 72*С - ЗО циклів; 2 хв. при 72Х один цикл, після чого зразки охолоджували до +4 °С і зберігали при даній температурі. Для подальшої ідентифікації відібрали дослідний зразок в об'ємі 5 мкл і проводили електрофорез. Спочатку приготували робочий розчин ТВЕбуфера для електрофорезу. Після готували 1,7%-й агарозний гель, вміщували його в конічну колбу і додавали 15 мкл броміда етідію, обережно перемішуючи. Розтоплену агарозу охолоджували до 50°С і заливали на платформу з гребінкою товщиною шара - 4 мм. Після застигання обережно виймали гребінку, а платформу переносили в електрофоретичну камеру і заливали 800 мл буфер ТВЕ так, щоб він укривав гель шаром ~ 3-4 мм. Далі 15 мкл продукту ампліфікації змішували з 5 мкл барвника (бромфеноловий синій). Далі камеру накривали кришкою І вмикали на 25 хв. Після сеансу електрофорезу агарозний гель поклали на екран УФ-трансілюмінатора, увімкнули його і обраховували отримані результати. Проба з пробірки з позитивним контролем, яка маркірована "+", повинна дати одну смугу, яка світиться жовтим кольором, а в пробі з негативним контролем, яка маркірована "-", такої полоси не повинно бути. Наявність смуги, яка світиться жовтим кольором, підтверджує про позитивну реакцію зразка на наявність ДНК C.trachomatis. Основну частину ДНК інактивували шляхом стерилізації при 100"С протягом 10 хвилин. Після стерилізації здійснювали контроль на стерильність, висіваючи розчин ДНК на м"ясопептонний агар, живильний бульйон та середовище Сабуро. На 3-й перевіряли посів. Контроль підтвердив відсутність бактеріального росту. Отриману таким чином аутовакцину стерильним шприцем залили в стерильні ампули. На ампулах наклеїли етикетки з прізвищем, ім'ям та по батькові хворого, рік народження та дату виготовлення аутовакцини. Ампули з аутовакцини зберігали при 5°С протягом 6 місяців. Аналогічно описаному Поикпаду готують РНК аутовакцину. Першу і другу вакцини змішали при співвідношенні: 1 частка розчину ДНК і 500 частин суспензії антигену. Суміш стерильним шприцем залили в ампули з фізіологічним розчином і запаяли. На ампулах наклеїли етикетки з прізвищем, ім'ям та по батькові хворого, рік народження та дату виготовлення аутовакцини. Ампули з аутовакцини зберігали при 5°С протягом 6 місяців. Тираж 50 екэ. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 «-72-89 ( 0 3 1 2 2 ) 2 - 5 7 - 0 3