Спосіб визначення функціонального стану індуцебельної no-синтазної системи у хворих з серцево-судинною патологією

Спосіб визначення характеристики стану індуцебельної NO-синтазної системи у хворих з серцево-судинною патологією, що включає взяття 5 мл крові, що вміщує гепарин, який відрізняється тим, що кров залишають стояти при 20 °С протягом двох годин, плазму крові розчиняють живильним середовищем 199 у співвідношенні 1:1 і повільно нашаровують на розчин фікол-верографіну та центрифугують при 1500 об./хв. протягом 30 хвилин, знімають кільце клітин та промивають від залишків фікол-верографіну шляхом центрифугування розчином повного живильного середовища, в який додають 80 мг/мл гентаміцину та 10 % роз U 2 (19) 1 3 вання. Кількість NO2- визначають за калібровочною кривою, побудованою для NaNO2. Цей процес має наступні недоліки: він потребує використання багатьох дорогих реагентів, окрім того, вміст нітрит-аніону залежить від багатьох екзогенних чинників, таких, як продукти харчування, що містять нітрити, якості води, повітря, застосування лікарських засобів, що містять сполуки азоту. Ці фактори значно знижують точність та достовірність результатів дослідження. Нітританіон є нестійким продуктом NO-синтазної реакції (період існування до 30 секунд), який схильний до подальших перетворень. Це знижує точність визначення, а тим самим ефективність лікування хворих на серцево-судинну патологію. Найбільш близьким по технічній суті процесу, що пропонується є процес визначення вмісту цитруліну - стабільного кінцевого продукту NOсинтазної реакції в сироватці крові хворих на серцево-судинну патологію. В конкретних варіантах застосування показник вмісту цітруліну в сироватці крові здійснюють таким чином. Після взяття проби крові з неї отримують сироватку, до 0,1 мл якої додають 0,9 мл фізіологічного розчину, проводять депротеінізацію додаванням 0,2 мл 2N НСlO4, суміш центрифугують при 10000 g на протязі 10 хв., до 0,4 мл супернатанту додають 2 мл реагенту (1 мл 59 мМ diacetyl-monoxim + 1 ml 32 mM antipyrine + 55 mМ ferric sulfate in 6M H2SO4), кип'ятять протягом 15 хв. на водяній бані і після охолодження визначають величину екстинції на спектрофотометрі при довжині хвилі 465 нм., в контрольну пробу додають 0,1 мл фізіологічного розчину, в стандартну пробу додають 0,1 мл 100 мкМ розчин цитруліну, вміст цитруліну розраховують по формулі: A  C мкмоль / л D В А - показник екстинції сироватки крові; В - показник екстинції стандарту; С - вміст цитруліну в стандартній пробі - 100 мкмоль/л; D - вміст цитруліну в пробі Але цей показник в сироватці крові відображує сукупну активність всіх трьох ізоформ NO-синтази, що не дає можливості оцінити активність саме індуцебельної NO-синтазної реакції, яка представлена в основному в імунокомпетентних клітинах периферійної крові (мононуклеарних клітинах моноцитах, лімфоцитах). Активність саме індуцебельної NO-синтази, яка значно підвищується в умовах активації імунокомпетентних клітин, що відповідають за розвиток системного запалення призводить до значної активації вільнорадикального окислення, кальцієвої перегрузки, денатурації білків при серцево-судинній патології. В основу винаходу поставлене завдання розробки процесу визначення активності індуцебельної NO-синтази у хворих на серцево-судинну патологію, в якому шляхом зміни дій, режимів, об'єкту дослідження та застосовуваних речовин забезпечується підвищення специфічності та точності оцінки спонтанної продукції оксиду азоту мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові. Для вирішення цього завдання спосіб визначення характеристики стану індуцебельної NO 57878 4 синтазної системи у хворих з серцево-судинною патологією передбачає взяття 5 мл крові, що вміщує гепарин. Новим у способі є те, що кров залишають стояти при 20 °С протягом двох годин, плазму крові розчиняють живильним середовищем 199 у співвідношенні 1:1 і повільно нашаровують на розчин фікол-верографін та центрифугують при 1500 об/хв. протягом 30 хвилин, знімають кільце клітин та промивають від залишків фікол-верографіну шляхом центрифугування розчином повного живильного середовища, в який додають 80 мг/мл гентаміцину та 10 % розчин телячої ембріональної сироватки, рахують кількість клітин у розчині в камері Горяєва на об'єктиві № 10, або 20, для отримання супернатанту в стерильні пеніцилінові флакони вносять 1 мл клітинної суміші, інкубують 24 години при температурі 37°С, вміст флаконів центрифугують при 1000 об./хв., відбирають надосадкову рідину, до 0,1 мл надосадкову рідини додають 0,4 мл фізиологічного розчину, проводять депротеінізацію додаванням 0,2 мл 2N НСІО4, суміш центрифугують при 10000g протягом 10 хв, до 0,4 мл супернатанту додають 2 мл реагенту (1 мл 59 мМ diacetyl-monoxim + 1 ml 32 mM antipyrine + 55 mМ ferric sulfate in 6M H2SO4), кип'ятять протягом 15 хв. на водяній бані і після охолодження визначають величину екстинції на спектрофотометрі при довжині хвилі 465 нм, в стандартну пробу додають 0,1 мл 1 мМ розчину цитруліну, і вміст цитруліну розраховують по формулі: A  1000 мкмоль В  3.10 9 кл.  1годину А - показник екстинції сироватки крові; В - показник екстинції стандарту; 1 година - час інкубації Визначення за способом активності NOсинтазної реакції шляхом визначення вмісту цитруліну дозволяє більш точно встановити показник що визначає несприятливий перебіг захворювання, більш точно визначити ступень тяжкості перебігу захворювання і, тим самим, підвищити ефективність диференційної діагностики та оптимізувати лікування хворих на серцево-судинну патологію. Спосіб що заявляється ілюструється прикладами його здійснення. В зазначених нижче прикладах спосіб здійснювали наступним чином: Для оцінки активності індуцебельної NOсинтази в якості показника використовували показник вмісту стабільного метаболіту NO-синтазної реакції - цитруліну в інкубаційному середовищі мононуклеарних клітин периферійної крові. Для цього 5 мл крові, що вміщує гепарин залишали стояти при 20 °С протягом двох годин. Для отримання моноцитарно-лімфоцитарної суміші плазму крові розчиняли живильним середовищем 199 у співвідношенні 1:1 і повільно нашаровували на розчин фікол-верографін (градієнт густини 1,0761,078) та центрифугували при 1500 об./хв. протягом 30 хвилин. Знімали кільце клітин та промивали від залишків фікол-верографіну два рази шляхом центрифугування розчином повного живильного середовища, в який додавали 80 мг/мл гентаміци 5 ну та 10 % розчин телячої ембріональної сироватки. Середу готували ex tempore. Кількість клітин у розчині раховували в камері Горяєва на об'єктиві № 10, або 20. Робоча концентрація клітин - 3 млн/мл. Для отримання супернатанту в стерильні пеніцилінові флакони вносили 1 мл клітинної суміші. Інкубували 24 години при температурі 37 °С. Після інкубації вміст флаконів центрифугували при 1000 об./хв., обережно відбирали надосадкову рідину. До 0,1 мл надосадкової рідини додавали 0,4 мл фізиологічного розчину. Проводили депротеінізацію додаванням 0,2 мл 2N НСІО4. Суміш центрифугували при 10000g протягом 10 хв. До 0,4 мл супернатанту додавали 2 мл реагенту (1 мл 59 мМ diacetyl-monoxim + 1 ml 32 mM antipyrine + 55 mМ ferric sulfate in 6M H2SO4), кип'ятили протягом 15 хв. на водяній бані і після охолодження визначали величину екстинції на спектрофотометрі при довжині хвилі 465 нм. В контрольну пробу замість надосадкової рідини додавали 0,2 мл фізиологічного розчину. В стандартну пробу додавали 0,1 мл 1 мМ розчину цитруліну. Вміст цитруліну розраховували по формулі: A  1000 мкмоль В  3.10 9 кл.  1годину А - показник екстинції сироватки крові; В - показник екстинції стандарту; 1 година - час інкубації Показник активності NO-синтазної реакції за вмістом цитруліну при спонтанній продукції NO в мононуклеарних лімфоцитах периферійної крові здорових донорів складає 65-35 мкмоль/109 клітин/годину, в той час, коли у хворих з несприятливим перебігом захворювання цей показник вищий за 65 мкмоль/109 клітин/годину. Приклад 1. Хворий С., 45 років, діагноз: Ішемічна хвороба серця, стенокардія напрягу, функціональний клас І, СН0. По вищеописаному процесу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,054; В 0,400; Розрахунок: [(0,054 х 1000мкмоль): (0,400 х 3.109)] = 45 мкмоль/109кл./год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові є 45 мкмоль/109кл./год., що є показником норми. Приклад 2. Хворий З., 55 років, діагноз: Ішемічна хвороба серця, стенокардія напрягу та покою, функціональний клас III, атеросклеротичний кардіосклероз, СНІІа. По вищеописаному процесу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,150; В - 0,450; Розрахунок: [(0,150 х 1000мкмоль): (0,450 х 3.109)] = 111 мкмоль/109кл./год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові є 111 мкмоль/109кл. /год., що є показником перевищення норми. Приклад 3. Хворий С., 57 років, діагноз: Ішемічна хвороба серця, нестабільна стенокардія, ФКІІІ, кардіосклероз, СНІІв. По вищеописаному проце 57878 6 су було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,175; В - 0,430; Розрахунок: [(0,175 х 1000мкмоль): (0,430 х 3.109)] = 135 мкмоль/109кл. /год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові є 135 мкмоль/109кл. /год., що є показником значного перевищення норми. Приклад 4. Хворий З., 50 років, діагноз: Гіпертонічна хвороба ІІ ст., без наявності коронарного атеросклерозу, гіпертензивне серце, СН0. По вищеописаному процесу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,075; В 0,450; Розрахунок: [(0,075 х 1000мкмоль): (0,450 х 3.109)] = 55 мкмоль/109кл. /год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові є 55 мкмоль/109кл. /год., що є показником норми. Приклад 5. Хворий Б., 52 роки, діагноз: гіпертонічна хвороба серця І-ІІ ст. без наявності коронарного атеросклерозу, кризовий перебіг захворювання. По вищеописаному способу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,110; В 0,420; Розрахунок: [(0,110 х 1000мкмоль): (0,420 х 3.109)] = 87 мкмоль/109кл. /год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної 9 крові є 87 мкмоль/10 кл. /год., що є показником перевищення норми. Приклад 6. Хворий М., 56 років, діагноз: гіпертонічна хвороба серця ll-lll ст. без наявності коронарного атеросклерозу. Тяжкий кризовий перебіг захворювання. По вищеописаному способу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А 0,145; В - 0,450; Розрахунок: [(0,145 х 1000мкмоль): (0,450 х 3.109)] = 107 мкмоль/109кл. /год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові є 107 мкмоль/109кл. /год., що є показником значного перевищення норми. Приклад 7. Хворий Ф., 42 роки, діагноз: ДКМП ділятаційна кардіоміопатія СНІІа. По вищеописаному процесу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,135; В - 0,440; Розрахунок: [(0,135 х 1000мкмоль): (0,440 х 3.109)] = 102 мкмоль/109кл. /год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові є 102 мкмоль/109кл. /год., що є показником значного перевищення норми. Приклад 8. Хворий Д., 48 років, діагноз: Ревматизм у стадії ремісії, комбінована мітральна та аортальна вада серця, кардіосклероз, СН0. По вищеописаному процесу проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,065; В - 0,430; Розрахунок: [(0,065 х 1000мкмоль): (0,430 х 3.109)] = 50 мкмоль/109кл. /год. Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної 7 57878 крові є 50 мкмоль/109кл. /год., що є показником норми. Приклад 9. Хворий Ф., 49 років, діагноз: Ревматизм в стадії ремісії, комбінована мітральна вада серця, кардіосклероз, СНІІв. По вищеописаному процесу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: А - 0,165; В 0,450; Розрахунок: [(0,165 х 1000мкмоль): (0,450 х 3.109)] = 122 мкмоль/109кл. /год. Комп’ютерна верстка Л. Купенко 8 Вміст цитруліну при спонтанній продукції NO мононуклеарними лімфоцитами периферійної крові є 122 мкмоль/109кл/год., що є показником значного перевищення норми. На порівняння з прототипом спосіб дає можливість диференційованого підходу до діагностики різних серцево-судинних захворювань, перебіг яких супроводжується активацією NO-синтазної системи, що дає можливість оптимізації лікувального процесу. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601