Спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм

Спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм, що включає вве 3 властивостей наноматеріалів на основі методу ДНК-комет. Суть способу полягає в проведенні електрофорезу в мікрогелях для детекції пошкоджень ДНК в окремих клітинах. Міграція ДНК до аноду тим більше, чим більше розривів містить ДНК [5]. Але даний спосіб не дає можливості проведення простого морфологічного аналізу пошкоджень ДНК та їх параметричної оцінки. Значна частина пошкоджень ДНК, що виявляються методом ДНК-комет, не може бути ідентифікована у результаті репарації ДНК. Спостерігається варіабельність результатів дослідження, що пов'язана з процесом підготовки препаратів і аналізом зображень. Задачею корисної моделі є вдосконалення способу прогнозування токсичної дії наночасток, виявлення можливих молекулярних механізмів впливу наносрібла на живі організми для попередження негативних наслідків дії наносрібла на працівників та населення в цілому при різних технологіях виробництва та використанні наночасток срібла. Технічний результат, який одержують в результаті вирішення задачі, полягає у встановленні змін рівнів мРНК 6-фосфофрукто-2кіназа/фруктозо-2,6-бісфосфатаза (PFKFB-2) та її альтернативних сплайс-варіантів у життєво важливих органах щурів (легенях, головного мозку, сім'яниках, серці, нирках), що може слугувати важливим чутливим показником дії на організм наночасток срібла. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, що включає введення наночасток срібла та їх дослідження в біологічних об'єктах згідно корисній моделі після введення наночасток срібла виділяють тотальні РНК із легень, головного мозку, сім'яників, серця і нирок щурів з подальшим проведенням полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК), виявляють зміни в експресії мРНК 6-фосфофрукто-2кіназа/фруктозо-2,6-бісфосфатаза (PFKFB-2) та її альтернативних сплайс-варіантів і за змінами рівнів експресії прогнозують негативного впливу наночасток срібла на організм та ймовірність патологічних станів. Спосіб здійснюється наступним чином: Тотальну РНК виділяють із 100-200 мг тканини, застосовуючи метод екстракції з використанням гуанідіну, фенолу та хлороформу. Спочатку проводять екстракцію тканин щурів 1 мл розчину ізотіоціанату гуанідіну (Ultra Pure), який містить 4 М ізотіоціанату гуанідину, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM EDTA та 100 mM 2-меркаптоетанолу. Потім до лізату тканин поступово додають 0,1 мл 2 М ацетату натрію, рН 4,0, 1 мл водонасиченого фенолу та 0,2 мл суміші хлороформу з ізоаміловим спиртом (49:1), перемішуючи після додавання кожного із реагентів. РНК осаджують рівним об'ємом ізопропанолу. Осади РНК промивають 75 % етанолом і розчиняють у воді, вільній від рибонуклеаз. Експресію мРНК PFKFB-2 досліджують методом полімеразної ланцюгової реакції кДНК. Для цього тотальну РНК із різних органів щурів викори 59442 4 стовують як матрицю для синтезу кДНК з допомогою оліго(dТ) праймера та Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, США) згідно протоколу виробника. Для зворотної транскрипції беруть 0,4 г тотальної РНК. Для ампліфікації кДНК PFKFB-2 - 1 л продукту реакції зворотної транскрипції, що відповідало 20 nг тотальної РНК, взятої у реакцію і HotStarTaq Master Mix Kit («QIAGEN», Німеччина). Ампліфікацію проводять у апараті «MasterCycler Personal» («Eppendorf», Німеччина), використовуючи один прямий 5'TGCCTCCTGAAGAACTACCATG-3' (1) та два зворотних праймери для двох типів мРНК PFKFB-2: 3'-CTGACTGCATCCTTAGCTG-5' (2) і 3'CAAGATGGCAAGTTGGGTC-5' (3). Для проведення кількісної полімеразної ланцюгової реакції (у реальному часі) кДНК PFKFB-2 використовують інші пари праймерів: 5'CTGACTGCATCCTTAGCTG-3' (4) і 3'CAAGATGGCAAGTTGGGTC-5' (5), які відповідають нуклеотидним послідовностям 1503-1522 (4) і 1563-1582 (5) опублікованої кДНК PFKFB-2 щура (GenBank номер NM_080477), а також 5'CCGTGCCCTGGATATGCAAG -3' (6) і 3'CAAGTGTTAATCTGAACATG-5' (7), які відповідають нуклеотидним послідовностям 1388-1407 (6) та 1536-1555 (7) варіанту кДНК PFKFB-2 щура (GenBank номер GQ422137). Для дослідження експресії альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 використовують специфічні для кожного сплайс-варіанту пари праймерів. Для альтернативного сплайс-варіанту мРНК PFKFB-2 з делецією восьмого екзону (-125; GenBank номер GQ422137) застосовують такі праймери: 5'-GCTGCCAATATTCTGGGACC-3' (прямий) та зворотний 3'GAACAGGAGATCCAGGACCT-5'. Для ампліфікації альтернативного сплайсваріанту мРНК PFKFB-2 з вставкою між 3-м та 4-м екзонами (+55; GenBank номер GQ422138) використовують прямий праймер 1, описаний вище, а зворотний праймер (3'GTCTGTTAGGCCAAGAAGTC-5'). Для вивчення експреси альтернативного сплайс-варіанту мРНК PFKFB-2 з делецією восьмого екзону (-125) та вставкою між 9-м і 10-м екзонами (+20) використовують такі праймери: 5'GATCCTGATGTCATTGCTGC-3' (прямий) та зворотний 3'-CCCAGTTTGCTCAGGCTCTGA-5'. Для ампліфікації альтернативного сплайсваріанту мРНК PFKFB-2 з делецією восьмого екзону (-125) та двома вставками між 1-м і 2-м екзонами (+10) і між 13-м і 14-м екзонами (+66) застосовують праймери для ділянки з вставкою між 1-м і 2-м екзонами: 5'-ATGCTGTGAGTTCTGCATGG-3' (прямий) та зворотний 3'GAAGCAGTCAAGTCCTATAA-5'. Кількісну полімеразну ланцюгову реакцію проводять на апараті «Stratagene Mx 3000P cycler», використовуючи SYBRGreen Mix. Аналіз результатів виконують з допомогою спеціальної комп'ютерної програми «Differential expression calculator» а статистичний аналіз - в Excel програмі. Експресія мРНК -актину слугує додатковим контролем кількості аналізуємої РНК. Для ампліфі 5 кації кДНК -актину використовують наступні праймери: прямий 5'CGTACCACTGGCATCGTGAT-3' та зворотний - 5'GTGTTGGCGTACAGGTCTTT-3' [48]. Продукти ампліфікації аналізують електрофорезом в 1 % або 2 % агарозному гелі, забарвлюючи ДНК бромистим етидієм. Гелі аналізують в системі Quantity One BioRad System (США). Отримані при ПЛР кДНК клонують у векторі pCRII-TOPO (Invitrogen). Клони аналізують електрофорезом в агарозному гелі, а фрагменти кДНК PFKFB-2 секвенують для ідентифікації сплайсваріантів мРНК PFKFB-2. Ензиматичну реакцію зростання ланцюга для секвенування ДНК проводять з допомогою спеціального набору (Dye terminator cycle sequencing kit; Applied Biosystems Inc.) та ДНК-термоциклера згідно рекомендаціям виробника. Продукти реакції секвенування аналізують автоматично в ДНК-секвенаторі (Applied Biosystems Inc.). Приклад конкретного виконання запропонованого способу: У досліджені використовували наночастки срібла у матриці NaCl, одержані методом електронно-променевого випаровування у вакуумі в лабораторії № 84 Міжнародного центру електронно-променевих технологій Інституту електрозварювання ім. Є. О. Патона. Методом електронної мікроскопії встановили, що частки срібла мають переважно сферичну форму і розміри 28-30 нм. Наночастки срібла вводили тваринам інтратрахеально у кількості 0,05 мг/кг маси тіла одноразово і досліджували експресію мРНК 6-фосфофрукто-2кіназа/фруктозо-2,6-бісфосфатаза (PFKFB-2) та її альтернативних сплайс-варіантів у легенях, головному мозку, сім'яниках та серці щурів через 1, 3,14 і 365 днів (по п'ять щурів у кожній групі). На Фіг. 1 та 2 показано аналіз впливу наночасток срібла на експресію мРНК PFKFB-2 та її альтернативну сплайс-форму у головному мозку, легенях, сім'яниках та серці. Ампліфікацію кДНК PFKFB-2 проводили з допомогою прямого та зво 59442 6 ротного праймерів методом кількісної полімеразної реакції. Величину експресії мРНК PFKFB-2 нормалізували по експресії -актину; n = 3; * - Р