Спосіб визначення токсичності мікотоксинів з використанням культури клітини кишечнику свині

Спосіб визначення токсичності мікотоксинів, який відрізняється тим, що включає використання суспензії культури клітин кишечнику свині ІРЕС1, із розрахунку 50000 клітин/мл та 200000 клітин/мл для визначення порівняльної токсичності трихотиценових мікотоксинів деоксиніваленолу, ніваленолу, 3-Ацетилдеоксиніваленолу та 15-ОАцетил-4-деоксиніваленолу. (19) (21) u200812350 (22) 20.10.2008 (24) 10.04.2009 (46) 10.04.2009, Бюл.№ 7, 2009 р. (72) ФОТІНА ТЕТЯНА ІВАНІВНА, UA, ЦИБУЛЬСЬКИЙ ДМИТРО ВІКТОРОВИЧ, UA, ДВОРСЬКА ЮЛІЯ ЄВГЕНІВНА, UA (73) СУМСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA 3 40420 INRA, Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, Toulouse, 2007]. Кишечник є головним місцем наявності забруднюючих речовин та токсинів, що знаходяться у кормі та воді, й являє собою перший бар'єр підчас проковтування контамінованого корму з можливими високими концентраціями мікотоксинів. Кишечник виконує бар'єрну функцію, що забезпечується епітеліальні кишковими клітинами ентероцитами, які забезпечують з одного боку фізичний бар'єр, а з іншого, приймають участь у здійсненні місцевої імунної реакції [Eckmann et al., 1995; Pitman et Blumberg, 2000]. Їхня участь у вродженому й набутому імунітеті відбувається за допомогою різних механізмів, таких як: продукція мукусу (слизу), антибактеріальних пептидів, продукція Ig А, запальних цитокінів [Oswald, 2006]. Численні фактори, такі як: гормони, протеази, цитокіни, нейротрансмітери, а також ксенобіотики можуть порушувати структуру й функцію кишкового епітеліального бар'єру. Кишечник є першим бар'єром під час проковтування контамінованого корму й може вражатися дією високих концентрацій мікотоксинів, які в свою чергу можуть порушувати здатність ентероцитів підтримувати бар'єрну функцію [Lewis et al., 1995]. Трихотиценові мікотоксини - одні з найнебезпечніших мікотоксинів, що продукуються, в основному, грибами роду Fusarium. Серед них основними є Т-2 токсин, ніваленол, деоксиніваленол та ін. [Ахметов Ф.Г., Иванов А.В., Тремасов М.Я. Профилактика микотоксикозов у животных //Ветеринария. -2001. -№2. -С.47-50]. Токсична дія трихотиценів проявляється головним чином у формі запалення слизових травного тракту, іноді до некротичного. Вони вражають також нервову й серцево-судинну системи, печінку, 4 пригнічують імунітет [Таrаnu I., Marin, D.E., Bouhet, S., Pascale, F., Bailly, J.D., Miller, J.D., Pinton, P., Oswald, I.P., 2005. Mycotoxin fumonisin B1 alters the cytokine profile and decreases the vaccinal antibody titer in pigs. www.sciencedirect.com]. Умовами для утворення даних токсинів є підвищена вологість й низька температура. Як правило, в одному продукті знаходять зразу декілька трихотиценів [Гогин А.Е. Микотоксикозы: значение и контроль //Ветеринария, 2006. -№3. -С.9-11. Труфанова В. Частота контамінації мікотоксинами кормів для птиці //Вет. Медицина України. -2004. №9. -С.26-28]. При визначенні токсичності враховували влив мікотоксинів на ріст і розвиток клітин. Приклад 1. Для відпрацьовування способу визначення токсичності мікотоксинів з використанням культури клітин кишечнику свині, використовували суспензію клітин із розрахунку 50000 клітин/мл., у кількості 0,1мл. на 1 лунку у досліді з визначення рівня росту клітин. Були досліджено по 4 концентрації для кожного з токсинів. Клітини помістили до термостату (t=39С, 5% СО2), а через 24 години додали токсини таким чином, що фінальна концентрація їх в розчині була 0,1 mМ, 1 mМ, 2 mМ та 5 mМ для кожного. Тривалість експозиції дорівнювала 24 та 48 годин. Аналізуючи отримані результати, щодо токсичного ефекту досліджуваних мікотоксинів на культуру клітин, слід зазначити, що було відмічено чітке поступове зниження росту клітин, що свідчить про достатню чутливість даної культури клітин до досліджуваних речовин й можливість її використання в експериментах з іншими хімічними та хіміотерапевтичними сполуками (таблиця 1). Таблиця 1 Пригнічення розвитку культури клітин ІРЕС-1 в присутності трихотиценових мікотоксинів Деоксиніваленол Ніваленол 3-Ацтилдеоксиніваленол 15-О-Ацетил-4-деоксиніваленол Контроль - 100% Деоксиніваленол Ніваленол 3-Ацтилдеоксиніваленол 15-О-Ацетил-4-деоксиніваленол Контроль - 100% 24 години 0,1 mМ -13,8% -37,4% -13,1% -10,9% 1 mМ -44,6% -51,6% -12,5% -50,3% 2 mМ -49,2% -55,2% -34,4% -51,3% 5 mМ -51% -57,1% -45,8% -54,8% 48 годин 0,1 mМ -8,7% -48,6% -3,1% -13,6% 1 mМ -55,7% -77,3% -19,1% -65,4% 2 mМ -62,6% -86,6% -49,1% -71,2% 5 mМ -68,9% -88% -65,3% -75,8% Приклад 2. Для визначення токсичності мікотоксинів на культурі клітин кишечнику свині було взято суспензію клітин із розрахунку 200000 клітин/мл., у кількості 0,5мл. на 1 фільтр. У досліді був визначений вплив деоксиніваленолу, ніваленолу, 3-Ацетилдеоксиніваленолу та 15-О-Ацетил4-деоксинівалеолу на розвиток клітин ІРЕС-1. Бу ли досліджені показники транс епітеліального опору клітин, клітинна проникність та вивільнення ензиму LDH із клітин під впливом токсинів. Фінальна концентрація деоксиніваленолу, ніваленолу, 3-Ацетилдеоксиніваленолу та 15-ОАцетил-4-деоксинівалеолу у дослідах дорівнювала 5 mМ для кожного. 5 40420 Дослід по визначенню показників опору тривав впродовж 11 днів. Вимірювання здійснювали кожен день в один і той же час за допомогою вольтметру. Отримані результати дозволяють ствер 6 джувати, що даний метод визначення токсичності мікотоксинів на клітинах ІРЕС-1 є ефективним (таблиця 2). Таблиця 2 Зниження показників транс епітеліального опору клітин ІРЕС-1 в присутності деоксиніваленолу, ніваленолу, 3-Ацетилдеоксиніваленолу та 15-О-Ацетил-4деоксинівалеолу Деоксиніваленол Ніваленол 3-Ацтилдеоксиніваленол 15-О-Ацетил-4-деоксиніваленол Контроль -100% Тривалість досліду, дн. 1 3 -32,6% -48,2% -18,1% -22,2% -10,8% -27,7% -33,9% -66,7% Дослідження клітинної проникності та рівня вивільнення ензиму LDH в процесі лізису клітин підтверджують попередньо отримані данні щодо токсичності представлених мікотоксинів. Цитотоксичний ефект деоксиніваленолу, ніваленолу та 15О-Ацетил-4-деоксинівалеолу становив 13%, 37% та 20% відповідно, а цитотоксичний ефект 3Ацетилдеоксиніваленолу дорівнював показникам контрольних клітин. 6 -60,7% -47,0% 3,3% -92,4% 9 -70,6% -40,5% -1,3% -97,3% 11 -76% -72,1% -13,2% -97,6% Проникність ентероцитів в присутності досліджуваних мікотоксинів підвищилась у 5; 4,5 та майже 11 разів в порівнянні з контрольними клітинами для деоксиніваленолу, ніваленолу та 15-ОАцетил-4-деоксинівалеолу, відповідно, в той час як показники 3-Ацетилдеоксиніваленолу дорівнювали показникам контрольних клітин (таблиця 3). Таблиця 3 Визначення рівня проникності клітин та вивільнення ензиму LDH клітинами ІРЕС-1 в присутності деоксиніваленолу, ніваленолу, Ацетилдеоксиніваленолу та 15-О-Ацетил4-деоксинівалеолу Деоксиніваленол Ніваленол 3-Ацтилдеоксиніваленол 15-О-Ацетил-4-деоксиніваленол Контроль - 0 (LDH); 100% (проникність клітин.) Напротязі всього етапу дослідження для проліферації клітин використовували поживне середовище, яке складається із: середовища DMEM НАМ F-12 - Sigma, USA, сироватки телячого ембріону, L-глютаміну (200мМ) виробник - Eurobio (Франція), водного розчину антибіотиків (пеніцилін й стрептоміцин) по 10000 ul/ml, рідини ITS (інсулін(5 mg/ml), трансферин (5 mg/ml) й селен (5 ng/ml)) та EGF (епідермальний фактор росту) - 100 mg/ml. Для диференціації - такий самий склад, але замість сироватки телячого ембріону додавали дексаметазон (20 mg/ml). Проведені дослідження показали, що культура клітин кишечнику свині ІРЕС-1 є гарною модельною тест-системою для визначення токсичності трихотиценових мікотоксинів. За допомогою наведених методів й використання культури клітин ми довели, що трихотиценові мікотоксини пригнічують бар'єрну функцію кишечнику, здійснюючи цитотоксичний вплив на ентероцити. Встановили, що 15О-Ацетил-4-деоксинівалеол є токсичним за деок Вивільнення ензиму LDH 13% 37% 0 20% Проникність клітин 501,0% 444,1% 103,8% 1093,0% синіваленол й в свою чергу 3-Ацетилдеоксиніваленол є найменш токсичним з поміж них трьох. При порівнянні токсичності деоксиніваленолу й ніваленолу слід зазначити, що ніваленол є більш токсичним для росту даної культури клітин, але деоксиніваленол виявляє сильніший цитотоксичний ефект на функціональну здатність клітин. Таким чином використання культури клітин ІРЕС-1, як способу визначення токсичності мікотоксинів, є доцільним, адже протягом наших досліджень вона зарекомендувала себе гарною тестсистемою, яка дозволяє у короткий термін визначити властивості речовин, їх токсичність та шкідливість й дає змогу робити висновки про доцільність їх подальшого вивчення для розробки нових засобів захисту тварин. Крім того, позитивними властивостями, якими відзначається даний метод, можна вважати його високу відтворну здатність і чутливість, низьку собівартість та більш швидке отримання результатів в порівнянні з класичними методами. 7 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 40420 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601