Спосіб оцінки розвитку порушень функціонування внутрішніх органів при гіпертензії в експерименті

Спосіб оцінки розвитку порушень функціонування внутрішніх органів при гіпертензії в експерименті, який полягає утому, що досліджують біологічні зразки, проводять оцінку одного з двох контрольних показників вмісту оксиду азоту у щурів, за зміною вмісту контрольних показників свідчать про виникнення дисфункції нирок при гіперте нзії внаслідок впливу стресу, який відрізняється тим, що як біологічні зразки використовують гомогенати тканин легень, серця та нирок, додатково як контрольний показник визначають вміст основ Шифа в нейтральних і фосфоліпідах, при підвищенні вмісту обох контрольних показників у серці свідчать про локальні патогенетичні зміни під впливом психоемоційного стресу, при підвищенні вмісту оксиду азоту та основ Шифа в нейтральних ліпідах у нирках свідчать про локальні патогенетичні зміни під сумісним впливом психоемоційного та токсичного стресу, при підвищенні лише вмісту основ Шифа в фосфоліпідах легень свідчать про патогенетичні зміни у легенях під впливом токсичного стресу Винахід відноситься до біохімії, і може бути використаний в експериментальній медицині для оцінки супутнього ураження легень, серця, нирок за умов гіпертензії під впливом психоемоційних і/або токсичних факторів Відомий спосіб оцінки психологічного стресу як фактору ризику гіпертензії (див Hemodynamic and autonomic adjustments to real life stress conditions in humans / D Lucim, G Norbiato, M Clenci, M Pagam // Hypertension -2002- V 39, N1 - P184188), який включає оцінку рівня стресу за вмістом кортизолу у слині людини Свідчать про зростання кардюваскулярного ризику при гіпертензії за умов збільшення рівня кортизолу у слині Недоліком відомого рішення є обмеження області застосування лише оцінкою впливу емоційного стресу та ризику виникнення серцевосудинних порушень при гіпертензії, не передбачено прогнозування виникнення патогенезу внутрішніх органів, таких як легені, нирки Відомий спосіб оцінки ендогенної інтоксикації (див Метод діагностики ендогенної інтоксикації / Т Г Фецич, Ю Й Михайлович, М Ф Тімочко // Деклар Пат України №19649 А від 25 12 97 Бюл №6), який полягає у тому, що досліджують кров людини Визначають активність ферменту супероксиддисмутази та рівень перекисного окислення ЛІПІДІВ, розраховують коефіцієнт балансу про- та антиоксидантніх процесів Недоліком відомого способу є призначення лише для оцінки токсичного впливу на організм, крім того не передбачено прогнозування виникнення патогенезу окремих внутрішніх органів Відомий спосіб оцінки ендотеліальної дисфункції при гіпертензії (див Taddei S , Virdis A, Ghiadom L et al Endothehal dysfunction in hypertension // J Cardiovasc Pharmacol - 2001 V 38, Suppl 2- PS11-14), який включає дослідження вмісту оксиду азоту в крові і нирках щурів, за зниженням рівня NO свідчать про дисфункцію ендотелію периферичного і коронарного макро- і мікроциркуляторного русла та нирок та розвиток серцево-судинних порушень при гіпертензії Недоліками відомого способу є неспецифічність оціночних маркерів, тому, що, по-перше, проводять оцінку виникнення серцево-судинних порушень за дослідженням крові та нирок, а не серця експериментальних тварин, по-друге, оцінюють зниження рівня NO, яке не обов'язково є патогенетичним Відомий також спосіб оцінки судинної і гломерулярної дисфункції нирок при гіпертензії (США) (див Trolhet М R , Rudd М А , Loscaizo J Oxidative stress and renal dysfunction in salt-sensitive CO СЧ CD 62342 ланок метаболізму ЛІПІДІВ ОШ в НЛ є характерисV 24, N2 - P 116-123) - прототип, який полягає у тикою цитозольних ЛІПІДІВ, ОШ в ФЛ - показником тому, що досліджують сечу щурів У якості контрофункціональної ЦІЛІСНОСТІ мембран льних показників оцінюють вміст оксиду азоту і Дослідження по запропонованому способу циклічного гуанозинмонофосфату За зниженням проведені в Інституті терапії АМН України В рерівня контрольних показників свідчать про розвизультаті досліджень вмісту ОШ та оксиду азоту за ток окислювального стресу та, як наслідок, виникумов емоційного та токсичного стресу у дорослих нення судинної і гломерулярної дисфункції нирок білих щурів виявлено, що одночасне підвищення при гіпертензії вмісту ОШ і оксиду азоту спостерігається у серці під впливом психоемоційного стресу, який виклиНедоліком відомого рішення є обмеження обкали дією електричного струму Підвищення вмісту ласті застосування лише для оцінки виникнення ОШ в ФЛ без змін вмісту оксиду азоту виявлено в дисфункції нирок при гіпертензії, без урахування легенях під впливом токсичного стресу, який визмін в інших внутрішніх органах кликано тривалою дією алкоголю Підвищення В основу винаходу поставлена задача розробвмісту оксиду азоту та ОШ в НЛ у нирках спостеріки такого способу оцінки розвитку порушень функгали в результаті сумісного впливу психоемоційноціонування внутрішніх органів при гіпертензії в го та токсичного стресу експерименті, у якому вибір більш специфічних та інформативних біохімічних показників та біологічВикористання способу, що заявляється, у поного матеріалу забезпечить можливість оцінки рівнянні з прототипом, дозволяє оцінювати розвирозвитку порушень функціонування легень, серця, ток порушень функціонування внутрішніх органів, нирок при гіпертензії за умов емоційного та/або а саме легень, серця, нирок при гіпертензії на фоні токсичного впливу на організм емоційного та/або токсичного впливу на організм за рахунок підвищення специфічності та розшиЦя задача вирішується тим, що досліджують рення області застосування (див табл ) біологічні зразки, проводять оцінку у якості одного з двох контрольних показників вмісту оксиду азоту Відтвореність - ступінь вірогідності відмінносу щурів, за зміною вмісту контрольних показників тей не перевищує 5% свідчать про виникнення дисфункції нирок при гіпертензії внаслідок впливу стресу Таблиця Відрізняючими ознаками винаходу у порівнянні з прототипом є те, що Перевага заявляемого способу над відомим (про- у якості біологічних зразків використовують тотипом) гомогенати тканин легень, серця та нирок, - додатково у якості контрольного показника Показники, що Заявляємий № Прототип визначають вміст основ Шифа (ОШ) в нейтральних порівнюють спосіб (НЛ) і фосфоліпідах (ФЛ), Гомогенами - при підвищенні вмісту обох контрольних потканин леДослідний ма1 Сеча щурів казників у серці свідчать про локальні патогенетигень, серця, теріал чні зміни під впливом психоемоційного стресу, нирок - при підвищенні вмісту оксиду азоту та ОШ в Оксид азоту та Оксид азоту НЛ у нирках свідчать про локальні патогенетичні циклічний гуаБІОХІМІЧНІ кри2 та ОШ в НЛ і зміни під сумісним впливом психоемоційного та нозинмонофотерії ФЛ токсичного стресу, сфат - при підвищенні лише вмісту ОШ в ФЛ легень Емоційний Вид стресу, дію свідчать про патогенетичні зміни у легенях під 3 Окислювальний та/або токсиякого оцінюють впливом токсичного стресу чний Використання у якості біологічних зразків гоОцінка дисмогенатів тканин легень, серця та нирок обумовРозширення Оцінка дисфун- функції лелено тим, що ці органи є найбільш уразливими за гень, серця, 4 області засто- кції нирок при умов стрес-стимульованої гіпертензії, саме зміни в нирок при гісування гіпертензії цих органах є патогенетичними пертензії Визначення в якості критерію окрім вмісту оксиду азоту концентрації ОШ обумовлено тим, що Запропонований спосіб здійснюють у такій ПООШ є кінцевими продуктами перекисного окисленСЛІДОВНОСТІ ня ЛІПІДІВ (ПОЛ), інтенсивність якого визначає ста1 Для оцінки розвитку порушень функціонубільність і як наслідок реалізацію протекторних та вання внутрішніх органів при гіпертензії досліджурегуляторних властивостей N0 За умов активації ють біологічні зразки експериментальних тварин окислювальних процесів зростає ризик виникнення 2 Проводять оцінку змін вмісту контрольних дефіциту N0 на тлі незмінного його синтезу (внапоказників, одним із яких є вміст оксиду азоту слідок його руйнування або використання як анти3 Згідно винаходу проводять біохімічне досліоксиданту) Поєднана активація ПОЛ та синтезу дження вмісту оксиду азоту та ОШ в НЛ і ФЛ серN0 призводить до утворення значної КІЛЬКОСТІ виця, легень та нирок експериментальних тварин сокотоксичної сполуки - пероксинітриту, який є Для цього одночасно групі тварин провокують індуктором апоптозу та потужним фактором ураемоційний стрес, наприклад, шляхом болючих ження тканин переривчастих (15 с - вплив, 45 с - перерва) елекВизначення ОШ у фракціях ФЛ і НЛ зумовлено тричних подразнень протягом ЗО хв Використовутим, що ці показники віддзеркалюють стан різних ють освітлену камеру, до підлоги якої підведений hypertension // Kidney Blood Press Res- 2001 62342 елеісгричнии струм, замикання контактів для його ту подачі здійснюють за допомогою маніпулятора Можливість здійснення запропонованого споПоріг чутливості визначають для кожної тварини собу підтверджується прикладами індивідуально, напруга не вище 50В ПеріодичПриклад 1 Оцінка патогенетичних змін під ність впливу - один сеанс раз на добу протягом 3-х впливом психоемоційного стресу тижнів до появи у щурів стійкої гіпертензії, яку конПроводять біохімічне дослідження вмісту октролюють по стабільно підвищеному артеріальносиду азотута ОШ в НЛ і ФЛ серця, легень та нирок му тиску або протягом 3-х МІСЯЦІВ білих щурів Модулюють токсичний стрес, наприклад, шляДля цього викликають емоційний стрес, наприхом впливу алкоголю протягом 10 МІСЯЦІВ прийому клад, шляхом болючих електричних подразнень 30% спирту щодня без обмежень, окремій групі одночасно групі тварин в результаті переривчастотварин - після дії електричного струму го впливу (15 с - вплив, 45 с - перерва) протягом ЗО хв Використовують освітлену камеру, до підлоТиск контролюють за допомогою медичного ги якої підведений електричний струм, замикання тонометра, для цього манжету накладають на контактів для його подачі здійснюють за допомохвіст гою маніпулятора Поріг чутливості визначають Контрольна група - інтактні тварини ВІДПОВІДдля кожної тварини індивідуально, напруга не виНОГО віку ще 50 В Періодичність впливу - один сеанс раз на Проводять декапітацію тварин, тканини оргадобу протягом 3-х тижнів до появи у щурів стійкої нів (100 мг/мл) гомогенізують в фізіологічному розгіпертензії, яку контролюють по стабільно підвичині щеному AT або протягом 3-х МІСЯЦІВ Контрольна За запропонованим способом проводять біогрупа - інтактні тварини ВІДПОВІДНОГО віку хімічне дослідження зразків тканин, яке включає визначення вмісту оксиду азоту та ОШ відомими Проводять декапітацію тварин, тканини оргаметодами нів (100 мг/мл) гомогенізують в фізіологічному розчині Для дослідження оксиду азоту можна визначати вміст його стабільного метаболіту - нітриту Для За запропонованим способом проводять біоцього 1 мл гомогенатів центрифугують 10 хв при хімічне дослідження зразків тканин, яке включає 5000 об/хв на центрифузі РС-6 при 4°С Зберігавизначення вмісту оксиду азоту та ОШ відомими ють при -20°С до аналізу Визначають вміст нітриметодами ту фотометричним методом за реакцією Гриса Для дослідження оксиду азоту 1 мл гомогенатів Зразки депротеїнізують доданням 75 мМоль/л центрифугують 10 хв при 5000 об/хв на центриZnSO4 та 55 мМоль/л NaOH, центрифугують 15 хв фузі РС-6 при 4°С Зберігають при -20°С до аналіпри 3000 об/хв Вміст нітриту вимірюють у розчині, зу Визначають вміст стабільного метаболіту оксищо містить 1 % сульфонамід та 0,1 % N-1 ду азоту - нітриту фотометричним методом за нафтилетилендіаміндипдрохлорид в 5 % НСІ (див реакцією Гриса Зразки депротеїнізують і центриNakamura Т , Ohyama Y , Masuda H et al Chronic фугують, а потім вимірюють вміст нітриту, як вкаblocade of nitric oxide synthesis increases urinary зано раніше Оптичну ЩІЛЬНІСТЬ визначають із виendothelm-1 excretion // J of Hypertension -1997користанням багатоканального V 15, N 4 - P 373-382 ) за співвідношенням реагенмікроспектрофотометру фірми "Flow" (Великобритів згідно (див Смердова Л Н , Кишко ТО Изучетанія) або фотоколориметра КФК-3 ние влияния некоторых метаболитов на синтез Дослідження ОШ проводять, як вказано вище оксидов азота перитонеальными макрофагами Оптичну ЩІЛЬНІСТЬ визначають із використанням крыс // Укр биохим журн - 1999- Т 7 1 , N1 - С спектрофотометра СФ-26 (Росія) Результати до128-135) Оптичну ЩІЛЬНІСТЬ визначають із викослідження ристанням багатоканального мікроспектрофотоВміст нітриту становить метра фірми "Flow" (Великобританія) або колори- в легенях - 6,78 мкМоль/л гомогенату, (в конметра типу КФК-3 тролі - 7,15+0,34) - нижче контрольного рівня, Дослідження ОШ проводять в гептан- в серці - 8,16 (в контролі - 6,72+0,19) - вище ізопропанольних (4 6) екстрактах гомогенатів ткаконтрольного рівня, нин згідно, наприклад (див Львовская Е И , Волче- в нирках - 6,82 (в контролі - 6,1±0,13) - вище горский И А , Шемяков С Е , Лифшиц Р И Спектконтрольного рівня, рофотометр и чес кое определение конечных вміст ОШ в НЛ становить продуктов перекисного окисления липидов // Воп- в легенях - 0,9 ДЕ/г тканини, (в контролі росы мед химии -1991 -37, N1 - С 92-93) Оптич0,61 ±0,05) - вище контрольного рівня, ну ЩІЛЬНІСТЬ визначають із використанням спект- в серці - 0,41 (в контролі - 0,29±0,09) - вище рофотометра СФ-26 (Росія) контрольного рівня, 4 Свідчать про локальні патогенетичні зміни - в нирках 0,49 (в контролі - 0,32+0,07) - вище під впливом психоемоційного стресу при підвиконтрольного рівня, щенні рівня обох контрольних показників у серці вміст ОШ в ФЛ становить 5 Свідчать про локальні патогенетичні зміни - в легенях - 11,88 (в контролі - 10,8±1,4) - не під сумісним впливом психоемоційного та токсичвідрізняється від контрольного, ного стресу при підвищенні вмісту оксиду азоту та - в серці - 2,58 (в контролі - 1,6±0,1) - вище коОШ в НЛ у нирках нтрольного рівня, 6 Свідчать про патогенетичні зміни у легенях - в нирках - 2,48 (в контролі - 2,1±0,32) - не відпід впливом токсичного стресу при підвищенні різняється від контрольного вмісту ОШ в ФЛ легень без змін вмісту оксиду азоСвідчать про локальні патогенетичні зміни під 62342 впливом психоемоційного стресу при підвищенні рівня обох контрольних показників у серці Приклад 2 Оцінка патогенетичних змін під впливом токсичного стресу Проводять біохімічне дослідження вмісту оксиду азоту та ОШ в НЛ і ФЛ серця, легень та нирок щурів Модулюють токсичний стрес, наприклад, шляхом впливу алкоголю протягом 10 МІСЯЦІВ прийому 30% спирту щодня без обмежень, окремій групі тварин - після дії електричного струму Тиск контролюють за допомогою медичного тонометра, для цього манжету накладають на хвіст Контрольна група - інтактні тварини ВІДПОВІДНОГО віку Проводять декапітацію тварин, тканини органів (100 мг/мл) гомогенізують в фізіологічному розчині За запропонованим способом проводять біохімічне дослідження зразків тканин, яке включає визначення вмісту оксиду азоту та ОШ відомими методами Результати дослідження Вміст стабільного метаболіту оксиду азоту - нітриту становить - в легенях - 7,2 мкМоль/л гомогенату, (в контролі - 7,15+0,34) - не відрізняється від контрольного, - в серці - 6,51 (в контролі - 6,72+0,19) - не відрізняється від контрольного, - в нирках - 6,15 (в контролі - 6,1±0,13) - не відрізняється від контрольного, вміст ОШ в НЛ становить - в легенях - 1,1 ДЕ/г тканини, (в контролі 0,61 ±0,05) - вище контрольного рівня, - в серці - 0,27 (в контролі - 0,29±0,09) - не відрізняється від контрольного, - в нирках - 0,39 (в контролі - 0,32+0,07) - не відрізняється від контрольного, вміст ОШ в ФЛ становить - в легенях - 12,55 (в контролі - 10,8+1,4) - вище контрольного рівня, - в серці - 2,26 (в контролі - 1,6±0,1) - вище контрольного рівня, - в нирках - 2,42 (в контролі - 2,1±0,32) - не відрізняється від контрольного Свідчать про патогенетичні зміни у легенях під впливом токсичного стресу при підвищенні вмісту ОШ в ФЛ легень Приклад 3 Оцінка патогенетичних змін під сумісним впливом психоемоційного та токсичного стресу Проводять біохімічне дослідження вмісту оксиду азоту та ОШ в НЛ і ФЛ серця, легень та нирок білих щурів Викликають емоційний стрес, наприклад, шля Комп'ютерна верстка М Клюкш 8 хом болючих електричних подразнень, періодичність впливу - один сеанс раз на добу протягом 3-х тижнів, а токсичний стрес шляхом впливу алкоголю протягом 10 МІСЯЦІВ прийому 30% спирту щодня без обмежень, окремій групі тварин - після дії електричного струму Контрольна група - інтактні тварини ВІДПОВІДНОГО віку Проводять декапітацію тварин, тканини органів (100 мг/мл) гомогенізують в фізіологічному розчині За запропонованим способом проводять біохімічне дослідження зразків тканин, яке включає визначення вмісту оксиду азоту та ОШ відомими методами Результати дослідження Вміст стабільного метаболіту оксиду азоту - нітриту становить - в легенях - 6,81 мк Моль/л гомогенату, (в контролі - 7,15+0,34) - не відрізняється від контрольного, - в серці - 6,58 (в контролі - 6,72+0,19) - не відрізняється від контрольного, - в нирках - 9,11 (в контролі - 6,1±0,13) - вище контрольного рівня, вміст ОШ в НЛ становить - в легенях - 1,5 ДЕ/г тканини, (в контролі 0,61 ±0,05) - вище контрольного рівня, - в серці - 0,71 (в контролі - 0,29±0,09) - вище контрольного рівня, - в нирках - 1,1 (в контролі - 0,32+0,07) - вище контрольного рівня, вміст ОШ в ФЛ становить - в легенях - 13,60, (в контролі - 10,8+1,4) - вище контрольного рівня, - в серці - 1,72 (в контролі - 1,6±0,1) - не відрізняється від контрольного - в нирках - 1,99 (в контролі - 2,1 ±0,32) - не відрізняється від контрольного Свідчать про локальні патогенетичні зміни під сумісним впливом психоемоційного та токсичного стресу при підвищенні вмісту оксиду азоту та ОШ в НЛ у нирках Висновок Вказані приклади підтверджують можливість здійснення оцінки розвитку порушень функціонування внутрішніх органів, а саме легень, серця, нирок при гіпертензії в експерименті на фоні емоційного та/або токсичного впливу на організм з високою достовірністю та відтворюваністю Технічний результат Використання запропонованого способу в експериментальній медицині дозволяє оцінювати розвиток порушень функціонування внутрішніх органів, а саме легень, серця, нирок при гіпертензії на фоні емоційного та/або токсичного впливу на організм Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119