Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування Rhodococcus erythropolis ІMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи, а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. (19) (21) u201103813 (22) 29.03.2011 (24) 25.10.2011 (46) 25.10.2011, Бюл.№ 20, 2011 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, СОФІЛКАНИЧ АННА ПАВЛІВНА, КУНДЄЄВ МАКСИМ ДМИТРОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ 3 63962 або використану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 2% (об'ємна частка). На початку процесу або в середині експоненцІйної фази росту у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2% чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4%. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0% олієвмісних відходів (фузи, пересмажена олія). Кількість інокуляту - 5% від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28°C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу змогу підвищити у 1,4-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і здешевити процес біосинтезу. Приклад 1. Синтез ПАР за умов росту R. erythropolis 1MB Ас-5017 на промислових відходах. Культивування штаму ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3; MgSO4×7H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO4×7H2O-0,001%; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують: відходи оліє-жирових виробництв (фузи), використану (пересмажену) соняшникову олію, гліцерин і рідкі парафіни у концентрації 0,5 і 1,0% (об'ємна частка), гексадекан (контроль) у концентрації 2,0% (об'ємна частка), а також мелясу масовою часткою 0,5 і 1,0%. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5% відповідного джерела вуглецю. Кількість інокуляту - 5% від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'є 4 мом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28°C упродовж 120 год. Поверхневий натяг (as) визначають за допомогою напівавтоматичного тен-зіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності as від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. У разі вирощування R. erythropolis EK-1 на субстратах, що можуть знижувати поверхневий натяг (гексадекан, рідкі парафіни, олія та відходи її виробництва) перед вимірюванням цього показника культуральну рідину звільняють від залишкового субстрату обробкою гексаном (якщо штам вирощують на середовищі з гексадеканом або рідкими парафінами) чи бензином (якщо культивування штаму здійснюють на олієвмісних середовищах). Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР за умов росту R. erythropolis ЕК-1 на відходах різних виробництв. Таблиця 1 Синтез ПАР за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на відходах промислових виробництв Субстрат Відходи оліє-жирових виробництв Використана (пересмажена) соняшникова олія Концентрація субстрату,% 0,5 1,0 0,5 1,0 Меляса 0,5 1,0 Гліцерин 0,5 1,0 Рідкі парафіни 0,5 1,0 Гексадекан (контроль) 2,0 Як видно з наведених у табл. 1 даних, показники синтезу ПАР у процесі культивування штаму ЕК-1 на олієвмісних середовищах (ПАР* 4,8-5,0) не відрізняються від таких на гексадекані і рідких парафінах (ПАР* 4,6-4,8). У подальших дослідженнях як субстрат для вирощування R. erythropolis ІMB Ас-5017 використовують пересмажену олію, оскільки вона у великій кількості накопичується у різних закладах громадського харчування. Показники синтезу ПАР Е24,% ПАР* 38±2 4,3±0,21 7,9±0,2 7,9±0,2 40±2 5,0+0,25 8,5±0,3 20±1 2,0±0,10 4,8±0,24 7,7±0,2 65±3 37±1,5 8,9±0,3 9,0+0,3 2,0±0,10 3,3±0,16 40±2 7,0+0,2 37+1,5 2,1±0,10 7,1±0,2 47±2 3,2+0,16 39±2 4,3±0,21 7,0±0,2 7,1+0,2 47±2 4,6+0,23 7,0+0,2 40±2 4,8±0,24 рHкінцеве Приклад 2. Вплив глюкози на синтез ПАРза умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на олієвмісних середовищах Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 2,0% (об'ємна частка). На початку процесу культивування, у середині експоненційної (48 год.) і стаціонарній фазі (72 год.) у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,050,3%. Вибір вуглеводів як додаткового субстрату 5 63962 був зумовлений тим, що ПАР R. erythropolis ЕК-1 за хімічною природою є гліколіпідами (трегалозоміколатами), а отже внесення глюкози за умов росту штаму ІMB Ас-5017 на олієвмісному середовищі може інтенсифікувати синтез ПАР за рахунок наявності майже готових блоків у середовищі культивування. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі з 1% олії. Кількість Інокуляту - 5% від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28°C упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 М НСІ, воронку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл ІМ НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. 6 Дані з впливу різних концентрацій глюкози і моменту її внесення у олієвмісне середовище на синтез ПАР штамом ІMB Ас-5017 наведено у табл. 2. Як видно з наведених у табл. 2 даних, внесення в олїєвмісне середовище на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента глюкози масовою часткою 0,1-0,2% супроводжується підвищенням у 2-3 рази концентрації синтезованих ПАР порівняно з показниками на середовищі без вуглеводів і в 1,4-2 рази порівняно з найближчим аналогом. Приклад 3. Дослідження можливості заміни глюкози на мелясу за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на олієвмісних середовищах Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 2,0% (об'ємна частка). На початку процесу культивування і в середині експоненційної фази росту продуцента у середовище вносять мелясу масовою часткою 0,2 і 0,4%. Показники синтезу поверхнево-активних речовин визначають як описано у прикладі 2. Як засвідчують дані, наведені у табл. 2 і 3, у разі використання меляси замість глюкози за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на олієвмісних середовищах концентрація синтезованих ПАР і індекс емульгування культуральної рідини практично не змінюються. Таким чином, культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 на олієвмісних промислових відходах з внесенням на початку процесу або в експоненційній фазі росту глюкози масовою часткою 0,10,2% або меляси масовою часткою 0,2-0,4% дає змогу підвищити в 1,4-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і здешевити процес біосинтезу порівняно з найближчим аналогом. Таблиця 2 Залежність синтезу ПАР R. erythropolis 1MB Ас-5017 на пересмаженій олії від моменту внесення і концентрації глюкози Момент внесення глюкози Лаг-фаза (0 год.) Експоненційна фаза (48 год.) Стаціонарна фаза (72 год.) Контроль (без глюкози) Прототип Концентрація глюкози,% 0,05 0,1 0,2 0,3 0,05 0,1 0,2 0,3 0,05 0,1 0,2 0,3 0 0 рН Е24,% 7,2 7,2 7,2 7,2 7,0 7,0 7,0 7,1 7,1 7,1 7,3 7,5 7,0 9,3 42±2,1 47±2,3 45±2,2 39±2,0 42±2,1 42±2,1 43±2,1 40±2,0 38±1,9 38±1,9 50±2,5 51±2,6 42±2,1 45±2,2 Концентрація ПАР, г/л 2,6±0,13 5,1±0,25 3,6±0,18 2,1±0,10 2,5±0,12 3,6±0,18 4,5±0,22 3,11±0,15 2,8±0,14 2,8±0,14 2,6±0,13 2,6±0,13 1,7±0,09 2,5±0,12 Примітка. Умови культивування згідно прототипу: джерело вуглецю у середовищі - гексадекан у концентрації 2% (об'ємна частка), на початку стаціонарної фази росту у середовище вносять фумарат і цитрат натрію масовою часткою 0,2 і 0,1% відповідно. 7 63962 8 Таблиця 3 Вплив меляси на синтез ПАР за умов R. erythropolis ІMB Ас-5017 на пересмаженій олії Момент внесення меляси Лаг-фаза Експоненційна фаза Концентрація меляси,% 0,2 0,4 0,2 0,4 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський рН Е24,% Концентрація ПАР, г/л 7,2 7,2 7,0 7,0 47±2,3 45±2,2 42±2,1 43±2,1 5,0±0,25 3,5±0,18 3,3±0,17 4,4±0,22 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601