Спосіб днк-діагностики мажорної мутації df508 в гені трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу (cftr)

Спосіб ДНК-діагностики мажорної мутації ΔF508 в гені трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу (CFTR), який включає забір матеріалу у пацієнта, виділення ДНК фенольнохлороформним методом, ампліфікацію послідовності гена CFTR, що містить мутацію ΔF508 та 3 Найбільш близьким до заявленого способу за досягнутим результатом є спосіб діагностики муковісцидозу шляхом детекції мутації ΔF508 методом алель-специфічної ампліфікації з використанням двох пар праймерів на нормальний та мутантний алелі (патент РФ № 2151188, МПК C12Q1/68, C12N15/11, G01N33/48/, опубліковано 20.06.2000). Суть способу полягає у виявленні делеції ΔF508 гена трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу за допомогою методу алель-специфічної ПЛР з використанням двох пар праймерів на нормальний та мутантний алелі з подальшим аналізом результатів шляхом електрофоретичного фракціонування продуктів ПЛР у 4 % поліакриламідному гелі. Недоліком даного способу є нижча специфічність та значна тривалість процесу, обумовлена тим, що для діагностики муковісцидозу необхідне проведення двох паралельних реакцій ПЛР для визначення мутації в різних пробірках та крос-контамінація зразків на стадії електрофоретичного фракціонування. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу розробки такого способу ДНКдіагностики мажорної мутації в гені трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу (CFTR), який би був більш специфічним та менш тривалим. Поставлена задача вирішується за рахунок створення умов для виявлення мутації за одну реакцію ПЛР в одній пробірці, скорочення тривалості ампліфікації та уникнення стадії електрофоретичного фракціонування. Поставлена задача вирішується запропонованим способом ДНК-діагностики мажорної мутації ΔF508 в гені трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу (CFTR), який включає забір матеріалу у пацієнта, виділення ДНК фенольнохлороформним методом, ампліфікацію послідовності гена CFTR, що містить мутацію ΔF508 та наступний аналіз продуктів ампліфікації за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в реальному часі, а відповідно до пропозиції детекцію мутації проводять з застосуванням гібридизаційних зондів типу TaqMan для нормального та мутантного алелів, при цьому для детекції нормального алеля використовують зонд - HEXAACACCAAAGATGATATT-BHQ1, а для детекції алеля делецією з ΔF508 Cy5GGAAACACCAATGATATTBHQ2, праймери для обох зондів: прямий AGTTTTCCTGGATTATGCCT; зворотній AGTTGGCATGCTTTGATGAC, а за результатами дослідження виявляють мажорну мутацію чи її відсутність. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де: на Фіг. 1 схематично приведено діаграму алельної дискримінації зразків ДНК, де  - зразок без мутації; ▲ - гетерозиготний носій мутації; ♦ - негативний контроль ампліфікації (НК); на Фіг. 2 - схематично приведено діаграму алельної дискримінації контрольних зразків ДНК, де - носії мутації в гомозиготному стані; ▲ - гетерозиготний носій мутації. Діагностику проводять за наявністю флуоресцентних сигналів специфічних зондів: 64654 4 - у випадку зразка без мутації фіксують флуоресцентний сигнал HEX та відсутність флуоресцентного сигналу Су5; - у випадку носія мутації у гетерозиготному стані фіксують одночасно флуоресцентні сигнали обох зондів; - у випадку мутації у гомозиготному стані спостерігають флуоресцентний сигнал Су5. З метою контролю якості запропонованого способу проводили "сліпий" аналіз 18 зразків ДНК, серед яких були нормальні зразки ДНК, зразки з делецією у гомо- та гетерозиготному станах. Було виявлено: 12 нормальних зразків, 5 носіїв делеції ΔF508 у гетерозиготному стані, одного носія ΔF508 у гомозиготному стані, що було підтверджено незалежними методами. Суттєвими відмінностями заявленого способу в порівнянні з відомим є наступні: 1. У заявленому способі в порівнянні з відомим використовують принципово новий підхід ПЛР в реальному часі з застосуванням гібридизаційних зондів типу TaqMan, який є більш специфічним методом. 2. Аналіз мутації ΔF508 проводять в одній пробірці. 3. Заявлений спосіб дозволив проводити діагностику мутації ΔF508 тривалістю півтори години (у відомих способах подібна діагностика триває приблизно чотири години). 4. Виключається стадія електрофоретичного фракціонування продуктів ПЛР. Корисна модель ілюструється наступними прикладами конкретного застосування. Приклад 1. Геномну ДНК 13 індивідів з загальної популяції виділяли з периферійної крові з використанням протеїнази К та очищували за допомогою фенольно-хлороформної екстракції. Суміш для ампліфікації об'ємом 25 мкл містила: двократний ампліфікаційний буферний розчин з KСl (виробництво фірми Fermentas, Литва); MgCl2 - 3,75 мМ; бичачий сироватковий альбумін - 170 мкг/мл; ДНТФ - 400 мкМ кожного типу;концентрація праймерів - 10 мкМ; концентрація зондів - 5 мкМ; ДНК 1 мкг; Taq-полімераза - 0,5 од. активності на пробу. Для ампліфікації використовували систему праймерів прямий -AGTTTTCCTGGATTATGCCT; зворотній - AGTTGGCATGCTTTGATGAC та флуоресцентних зондів типу TaqMan, гомологічні послідовності без мутації HEXAACACCAAAGATGATATT-BHQ1, та послідовності з делецією ΔF508 Су5GGAAACACCAATGATATTBHQ2 за допомогою методу ПЛР в реальному часі. Використовується двоступінчастий режим ампліфікації (95 °С - 20 с, 54 °С - 50 с ) впродовж 35 циклів до досягнення ампліфікаційними кривими стадії "плато". Реєстрація флуоресцентних сигналів HEX та Су5 відбувалася наприкінці стадії "елонгації". Результати алельної дискримінації зразків наведено на Фіг. 1. За результатами аналізу було встановлено гетерозиготне носійство делеції ΔF508 у трьох зразках ДНК (праве верхнє поле діаграми), 10 зразків ДНК мали нормальний генотип (праве нижнє поле на діаграмі). 5 Приклад 2. Геномну ДНК хворої дитини з діагнозом муковісцидоз, а також батьків дитини та здорового брата хворого виділяли з периферійної крові з використанням протеїнази К та очищували за допомогою фенольно-хлороформної екстракції. Суміш для ампліфікації об'ємом 25 мкл містила: двократний ампліфікаційний буферний розчин з KСl (виробництво фірми Fermentas, Литва); MgCl2 3,75 мМ; бичачий сироватковий альбумін - 170 мкг/мл; ДНТФ - 400 мкМ кожного типу; концентрація праймерів - 10 мкМ; концентрація зондів - 5 5 мкМ; ДНК - 1 мкг; Taq-полімераза - 0,5 од. активності на пробу. Для ампліфікації використовували систему праймерів прямий AGTTTTCCTGGATTATGCCT; зворотній AGTTGGCATGCTTTGATGAC та флуоресцентних зондів типу TaqMan, гомологічні послідовності без мутації - НЕХ-AACACCAAAGATGATATT-BHQ1, та послідовності з делецією ΔF508 - Су5GGAAACACCAATGATATTBHQ2 за допомогою 64654 6 методу ПЛР в реальному часі. Використовується двоступінчастий режим ампліфікації (95 °С - 20 с, 54 °С - 50 с) впродовж 35 циклів до досягнення ампліфікаційними кривими стадії "плато". Реєстрація флуоресцентних сигналів HEX та Су5 відбувалася наприкінці стадії "елонгації". Результати алельної дискримінації зразків наведено на Фіг. 2. В результаті аналізу у хворої дитини було виявлено делецію ΔF508 у гомозиготному стані (зразок 1), у батьків дитини (зразки 2, 4) та брата хворого (зразок 3) було виявлено ΔF508 у гетерозиготному стані. Таким чином, отримані діаграми алельної дискримінації демонструють, що запропонований спосіб діагностики делеції ΔF508 є ефективним та функціонально придатним та може бути використаний для детекції даної мажорної делеції серед хворих на муковісцидоз та членів їх родин, а також для скринінгу населення. 7 64654 8 В описі до патенту на корисну модель графічні зображення та текст подаються в редакції заявника Комп’ютерна верстка Л. Купенко Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601