Спосіб діагностики прихованої хромосомної нестабільності в лімфоцитах крові людини

1. Спосіб діагностики прихованої хромосомної нестабільності в лімфоцитах крові людини, що включає провокацію пошкодження геному хімічною сполукою (блеоміцином). 3 не пригнічуючи мітотичної активності клітин, індукують достовірне підвищення частоти хромосомних аберацій - вживання різних типів клітин для моделювання цитогенетичного ефекту (лімфоцити крові людини, лінії лімфобластоїдних клітин людини); - використання різних типів хромосомних аберацій та цитогенетичних показників (частота аберацій або аберантних метафаз) як маркерів прихованої хромосомної нестабільності; - відсутність кількісних критеріїв оцінки ступеня чутливості хромосом соматичних клітин людини до тестуючої дії блеоміцину. Вказані недоліки суттєво ускладнюють інтерпретацію та порівняння результатів, отриманих різними дослідниками. В основу корисної моделі поставлено задачу створення уніфікованого чутливого методу діагностики та оцінки прихованої хромосомної нестабільності в соматичних клітинах людини. Як модельну тест-систему для визначення індивідуальної чутливості хромосом людини до дії мутагенів використано короткотермінову 4-8годинну культуру лімфоцитів периферичної крові, яку обробляють на більш чутливій до дії мутагену пізній постсинтетичній G2 стадії першого мітотичного циклу двома оптимальними концентраціями блеоміцину (0,05 та 5,00 мкг/мл), які, не пригнічуючи мітотичної активності клітин, індукують достовірне підвищення частоти хромосомних аберацій (без множинної фрагментації чи пульверизації хромосом), що дозволяє отримати достатню кількість метафаз, якість яких відповідає вимогам, необхідним для коректного цитогенетичного аналізу, та виявляти максимальну варіабельність індивідуальних показників прихованої хромосомної нестабільності. Як основний цитогенетичний критерій чутливості хромосом людини до тестуючого мутагенного навантаження блеоміцином вперше запропоновано вживати загальну частоту всіх типів аберацій хромосом, а не аберантних метафаз. Для кількісної оцінки ступеня чутливості хромосом людини до тестуючої дії блеоміцину використовано коефіцієнт прихованої хромосомної нестабільності (К ПХН ) , який обчислюється за спрощеною нами формулою [10]: К ПХН  МПХН / М , де МПХН - індивідуальні значення частоти аберацій хромосом при додаванні тестуючого мутагену (блеоміцину) в концентраціях 0,05 та 5,00 мкг/мл у індивідуума; М - граничні значення норми для частоти аберацій хромосом при додаванні тестуючого мутагену (блеоміцину) в концентраціях 0,05 та 5,00 мкг/мл. Прийняли, що для гіперчутливих осіб цитогенетичний ефект, індукований блеоміцином, перевищує середньогруповий рівень хромосомних аберацій, тому КПХН буде > 1. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. Для цитогенетичного аналізу використовують цільну венозну кров (~ 3 мл від однієї особи), яку 64932 4 вміщують в стандартну 5 мл стерильну пробирку з напиленням гепарину (Sarstedt, Germany) і зберігають в холодильнику не більше 24-х годин до постановки культури. Лімфоцити культивують у стандартних 15 мл стерильних одноразових пробірках (Sarstedt, Germany) в термостаті при температурі 37 °С Культуральна суміш не містить антибіотиків і ембріональної телячої сироватки і складається з наступних компонентів: 0,5 мл цільної крові + 5,0 мл живильного середовища RPMI1640 з L-глютаміном (Sigma, USA) + 0,01 мл фітогемаглютиніну (Difco "Р", США). Культуру лімфоцитів інкубують протягом 52-х годин. На 48-й годині (пізня постсинтетична фаза першого мітотичного циклу) в культуру додають блеоміцин в стерильному фізіологічному розчині в кінцевих концентраціях в культурі 0,05 та 5,00 мкг/мл. Для зупинки розподілу лімфоцитів на стадії метафази використовують колцемід (Sigma, США), який для максимально можливої синхронізації культури і накопичення достатньої для цитогенетичного аналізу кількості метафазних платівок добавляють в культуру за 4 години до фіксації, у кінцевій концентрації 0,5 мкг/мл. Гіпотонічну обробку клітин проводять виготовленим ex tempore та нагрітим до 37 °С 0,075 М розчином хлористого калію - протягом 20 хвилин при температурі 37 °С (в термостаті), після чого клітинний осад фіксують свіжовиготовленою охолодженою сумішшю абсолютного етанолу та крижаної оцтової кислоти (3 : 1) із триразовою зміною фіксатора. При необхідності осад зберігають у морозильній камері при температурі 20 °С до моменту приготування препаратів метафазних хромосом. Для приготування препаратів метафазних хромосом 5-7 крапель клітинної суспензії наносять на знежирене, вологе скло, яке 23 сек. підсушують на термостолику при температурі 45° С, після чого з метою покращення розкиду хромосом в метафазах обробляють 50 % розчином оцтової кислоти протягом 20 сек. Препарати зашифровують та фарбують 2 % розчином барвника Гімза (Giemsa stain, Merk, Німеччина) протягом 5-ти хвилин для проведення традиційного цитогенетичного аналізу рівномірно забарвлених хромосом. Класичний цитогенетичний аналіз проводять "всліпу", на зашифрованих препаратах. Дешифровку одержаних результатів виконують після закінчення хромосомного аналізу всіх випадків. Від кожної особи аналізують від 200 до 500 метафаз, що відповідають встановленим вимогам. При проведенні цитогенетичного аналізу проводять групове каріотипування. Для оцінки стабільності хромосомного апарата враховують всі аберації хроматидного та хромосомного типів - прості (ацентрики) та складні (симетричні та асиметричні хроматидні обміни; поліцентрики; центричні кільця; аномальні моноцентрики, сформовані в результаті транслокацій, інверсій та інсерцій), які можна вірогідно розпізнати при груповому каріотипуванні на рівномірно пофарбованих препаратах метафазних хромосом. Встановлюють частоти аберантних клітин (в %) та рівень всіх виявлених типів хромосомних аберацій (на 100 проаналізованих метафаз). Порівнюють цитогенетичний ефект при додаванні бле 5 оміцину на 48-й годині культивування, в кінцевих концентраціях 0,05 та 5,00 мкг/мл з таким при стандартному культивуванні інтактних лімфоцитів (без додавання блеоміцину), одержаних від обстеженого індивіда. Вірогідність різниці між отриманими даними проводять з використанням tкритерію Стьюдента. Технічна задача вирішується за рахунок того, що використовуються дві оптимальні концентрації блеоміцину (0,05 та 5,00 мкг/мл), які індукують достовірне підвищення частоти хромосомних аберацій без пригнічення мітотичної активності культури, якими обробляється культура лімфоцитів крові людини в найбільш чутливій до дії мутагену пізній постсинтетичній стадії першого мітотичного циклу. Окрім того, обробка культури лімфоцитів колцемідом (а не колхіцином) протягом останніх 4-х (а не двох) годин сприяє накопиченню клітин першого мітотичного розподілу, а додаткова обробка препаратів 50 % оцтовою кислотою оптимізує розкид хромосом в метафазах, що дає можливість одержати кількість якісних метафазних платівок, необхідну для коректного цитогенетичного аналізу. Перевагою способу, на відміну від прототипу, є його економічність (не використовується таке коштовне обладнання та реагенти як джерело іонізуючого випромінюваня, камера для підтримки температурного режиму при опроміненні крові, антибіотики та ембріональна теляча сироватка; за рахунок накопичення якісних мітозів з'являється можливість проаналізувати кількість метафаз, достатню для оцінки стабільності хромосомного апарата в культурі лімфоцитів людини при додаванні блеоміцину з використанням мінімальної кількості крові); інформативність (за допомогою способу можна виявити осіб з прихованою хромосомною нестабільністю, яка експресується в клітинах людини тільки при використанні мутагенупровокатора). Приклад 1 При цитогенетичному обстеженні пацієнта з раком легенів № 1 (чол., 50 p.) вихідний (фоновий) рівень хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові становив 1,6 на 100 проаналізованих метафаз. Цей показник знаходиться в межах норми загальноприйнятих популяційних значень (1,0 - 3,0 на 100 метафаз). Індивідуальна частота хромосомних аберацій, індукованих блеоміцином, становила 8,2 та 23,0 на 100 метафаз при концентраціях 0,05 та 5,00 мкг/мл, відповідно. Визначена верхня границя норми ПХН у осіб даної групи для загальної частоти хромосомних аберацій, яка дорівнює 47,13 та 55,95 на 100 метафаз, відповідно. Для обстеженого донора №1 КПХН становлять 8,2/47,13 = 0,17 та 23,0/55,95 = 0,41 (для концентрацій 0,05 та 5,00 мкг/мл, відповідно), що менше 1 і свідчить про відсутність прихованої хромосомної нестабільності. Приклад 2 При цитогенетичному обстеженні пацієнта з раком легенів № 2 (чол., 61 р.) вихідний (фоновий) рівень хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові становив 1,40 на 100 метафаз. Цей 64932 6 показник знаходиться в межах норми загальноприйнятих популяційних значень (1,0 - 3,0 на 100 метафаз). Індивідуальна частота хромосомних аберацій, індукованих блеоміцином, становила 109,25 та 99,59 на 100 клітин при концентраціях 0,05 та 5,00 мкг/ мл, відповідно. Визначена верхня границя норми ПХН у осіб даної групи для загальної частоти хромосомних аберацій, яка дорівнює 47,13 та 55,95 на 100 метафаз, відповідно. Для обстеженого донора № 2 К ПХН становлять 109,25/47,13 = 2,32 та 99,59/55,95 = 1,78 (для концентрацій 0,05 та 5,00 мкг/ мл, відповідно), що більше 1 і свідчить про наявність прихованої хромосомної нестабільності. Приклад 3 При цитогенетичному обстеженні пацієнта з раком легенів № 3 (чол., 47 р.) вихідний (фоновий) рівень хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові становив 2,60 на 100 метафаз. Цей показник знаходиться в межах норми загальноприйнятих популяційних значень (1,0 - 3,0 на 100 метафаз). Індивідуальна частота хромосомних аберацій, індукованих блеоміцином, становила 38,0 та 68,5 на 100 клітин при концентраціях 0,05 та 5,00 мкг/ мл, відповідно. Визначена верхня границя норми ПХН у осіб даної групи для загальної частоти хромосомних аберацій, яка дорівнює 47,13 та 55,95 на 100 метафаз, відповідно. Для обстеженого донора № 3 К ПХН становлять 38,0/47,13 = 0,81 та 68,5/55,95 = 1,22 (для концентрацій 0,05 та 5,00 мкг/мл, відповідно). І хоч при концентрації Бл 0,05 мкг/мл значення коефіцієнта ПХН менше 1, при концентрації Бл 5,00 мкг/мл значення коефіцієнта ПХН значно перевищує 1, що дозволяє вважати обстеженого індивіда гіперчутливим до мутагенної дії і підтверджує необхідність використання обох концентрацій Бл для визначення ПХН. Запропонований спосіб може бути використаний в установах охорони здоров'я для діагностики прихованої хромосомної нестабільності у людини внаслідок радіаційно-індукованої модифікації стабільності геному при формуванні груп ризику з осіб, які зазнали дії іонізуючої радіації, що має провідне значення для прогнозування та попередження віддалених медичних наслідків (зокрема, онкологічної патології) контрольованого чи неконтрольованого опромінення людини. Джерела інформації: 1. Scott D. Chromosomal radiosensitivity and low penetrance predisposition to cancer / D. Scot // Cytogen. and Genome Res. - 2004. - Vol. 104, № 14. - P. 365-370. 2. Natarajan T. Gamma-radiation-induced chromosomal mutagen sensitivity is associated with breast cancer risk in African-American women: caffeine modulates the outcome of mutagen sensitivity assay / T. Natarajan, N. Ganesan, P. Carter-Nolan [et al.] // Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. - 2006. - Vol. 15. - P. 437-442. 7 3. Hsu Т. С Mutagen sensitivity: a biological marker of cancer susceptibility / Т. С Hsu, M. K. Spitz, S. P. Schantz // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prevention. -2002.-Vol. 1.-P. 83-89. 4. Adema A. Comparison of bleomycin and radiation in G2 assay of chromatid breaks / A. Adema, J. Closs, R. Verheijen [et al.] // Int. J. Radiat. Biol. - 2003. - Vol. 79, № 8. -P. 655-661. 5. Does the bleomycin sensitivity assay express cancer phenotyre? / G. Szekely, E. Remenar, M. Rafsler [et al.] // Mutagenesis. - 2003. - Vol. 18, № 1. - P. 59-63. 6. Zajaczek S. Bleomycin test sensitivity in healthy children / S. Zajaczek, G. Krzanowskath Michalska, E.Pikula [et al.] // Abstracts of 4 Europ. Cytogenetics Conf., Bologna. -2003.-P. 43. Комп’ютерна верстка Л. Купенко 64932 8 7. Dabrowski P. Hidden chromosome instability and risk of laryngeal cancer incidence / P. Dabrowski, S. Kita, W. Szyfter [et al.] // Otolaryngol. Pol. - 1999. Vol. 53, № 3. -P. 245-251. 8. Gajecka M. Non-random distribution of chromatid breaks in lymphocytes of laryngeal squamous cell carcinoma patients / M. Gajecka, M. Jarmuz, W. Szyfter [et al.] // Oncology Reports. 2004. - № 12. - P. 153-157. 9. Closs J. Involvement of cell cycle control in bleomycin-induced mutagen sensitivity / J. Closs, O. Temmink, M. Ceelen [et al.] // Environm. and Molec. Mutagenesis. - 1999. -Vol. 40, №2.-P. 79-84. 10. Дьоміна Е. А., Дружина М. О., Рябченко Н. М. Індивідуальна радіочутливість людини / ІЕПОР ім. P. Є. Кавецького НАН України. - К.: Логос, 2006. - 126 с. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601