Спосіб виявлення хромосомної нестабільності в лімфоцитах крові нащадків опромінених людей

1. Спосіб виявлення віддаленої, прихованої та трансмісивної хромосомної нестабільності в лімфоцитах крові людини, який полягає у цитогенетичному аналізі препаратів метафазних хромосом, одержаних з довгострокової культури лімфоцитів периферичної крові, який відрізняється тим, що частоту хромосомних аберацій визначають в клітинах 5-го мітотичного розподілу. 3 15062 4 периферичної крові, одержаних від неопромінених приготування препаратів метафазних хромосом 5здорових осіб, де оцінюється спонтанні (а не інду7 крапель клітинної суспензії наносять на знежиковані) зміни стану геному в способі культивуванрене, вологе скло, яке 2-3сек. підсушують на терня, спостерігається поступове зниження мітотичної мостолику при температурі 45°С, після чого з меактивності культури при збільшенні тривалості тою покращення розкиду хромосом в метафазах інкубації клітин, що ускладнює можливість одеробробляють 50% розчином оцтової кислоти протяжання достатньої кількості якісних метафаз, необгом 20сек. Препарати зашифровують та фарбують хідних для проведення коректного цитогенетично2% розчином барвника Гімза (Giemsa stain, Merk, го аналізу. Німеччина) протягом 5-ти хвилин для проведення В основу корисної моделі поставлено завдантрадиційного цитогенетичного аналізу рівномірно ня підвищення чутливості способу визначення забарвлених хромосом. цитогенетичного статусу соматичних клітин нащаКласичний цитогенетичний аналіз проводять дків опромінених батьків шляхом визначення час"всліпу", на зашифрованих препаратах. Дешифрототи аберантних клітин та різних типів хромосомвку одержаних результатів виконують після закінних аберацій в метафазах 5-го мітотичного чення хромосомного аналізу всіх випадків. Від корозподілу при використанні модифікованого нами жної особи аналізують від 200 до 500 метафаз, що метода довгострокового (144-х-го динного) культивідповідають встановленим вимогам. При провевування лімфоцитів периферичної крові і удоскоденні цитогенетичного аналізу проводять групове наленого способу одержання якісних препаратів каріотипування. Для оцінки стабільності хромосометафазних хромосом. много апарату враховують всі аберації хроматидТехнічною задачею є максимально можлива ного та хромосомного типів - прості (ацентрики) та синхронізація довгострокової культури лімфоцитів, складні (симетричні та асиметричні хроматидні підвищення її мітотичноної активності при збільобміни; поліцентрики; центричні кільця; аномальні шенні тривалості культивування, отримання досмоноцентрики, сформовані в результаті транслотатньої кількості метафаз, якість яких відповідає кацій, інверсій та інсерцій), які можна вірогідно вимогам, необхідним для коректного цитогенетичрозпізнати при груповому каріотипуванні на рівноного аналізу. мірно пофарбованих препаратах метафазних хроЦе надасть можливість визначити приховану, мосом. Встановлюють частоти аберантних клітин віддалену та трансмісивну хромосомну нестабіль(в %) та рівень всіх виявлених типів хромосомних ність, індуковану в соматичних клітинах людини аберацій (на 100 проаналізованих метафаз). Порімалими дозами іонізуючого випромінювання, чи внюють цитогенетичний ефект при довгострокосупроводжуючу певні патологічні стани. вому культивуванні з таким при стандартному коЗаявлений спосіб здійснюється таким чином. роткотерміновому культивуванні лімфоцитів, Для цитогенетичного аналізу використовують одержаних від обстеженого індивіда і контрольних цільну венозну кров (~3мл від однієї особи), яку осіб. Вірогідність різниці між отриманими даними вміщують в стандартну 5мл стерильну пробірку з проводять з використанням t-критерію Ст'юдента. напиленням гепарину (Sarstedt, Germany) і зберіКласичний цитогенетичний аналіз проводять гають в холодильнику не більше 24-х годин до "всліпу", на зашифрованих препаратах. Дешифропостановки культури. Лімфоцити культивують у вку одержаних результатів виконують після закінстандартних 15мл стерильних одноразових пробічення хромосомного аналізу всіх випадків. Від корках (Sarstedt, Germany) в термостаті при темпежної особи аналізують від 200 до 500 метафаз, що ратурі 37°С. Культуральна суміш не містить антивідповідають встановленим вимогам. При провебіотиків і ембріональної телячої сироватки і денні цитогенетичного аналізу проводять групове складається з наступних компонентів: 0,5мл цількаріотипування. Для оцінки стабільності хромосоної крові +5,0мл живильного середовища RPMI много апарату враховують всі аберації хроматид1640 з L-глютаміном (Sigma, USA) +0,01мл фітоного та хромосомного типів - прості (ацентрики) та гемаглютиніну (Difco "P", США). Культуру лімфоскладні (симетричні та асиметричні хроматидні цитів інкубують протягом 144-х годин, що дозволяє обміни; поліцентрики; центричні кільця; аномальні аналізувати клітини переважно п'ятого культурамоноцентрики, сформовані в результаті транслольного мітозу. Для зупинки розподілу лімфоцитів кацій, інверсій та інсерцій), які можна вірогідно на стадії метафази використовують колцемід розпізнати при груповому каріотипуванні на рівно(Sigma, США), який для максимально можливої мірно пофарбованих препаратах метафазних хросинхронізації культури і накопичення достатньої мосом. Встановлюють частоти аберантних клітин для цитогенетичного аналізу кількості метафазних (в %) та рівень всіх виявлених типів хромосомних платівок добавляють в культуру за 6 години до аберацій (на 100 проаналізованих метафаз). Поріфіксації, у кінцевій концентрації 0,5мкг/мл. Гіпотовнюють цитогенетичний ефект при довгостроконічну обробку клітин проводять виготовленим ex вому культивуванні з таким при стандартному коtempore та нагрітим до 37°С 0,075М розчином роткотерміновому культивуванні лімфоцитів, хлористого калію - протягом 20 хвилин при темпеодержаних від обстеженого індивіда і контрольних ратурі 37°С (в термостаті), після чого клітинний осіб. Вірогідність різниці між отриманими даними осад фіксують свіжо виготовленою охолодженою проводять з використанням t-критерію Ст'юдента. сумішшю абсолютного етанолу і а крижаної оцтоТехнічна задача вирішується за рахунок того, вої кислоти (3:1) із триразовою зміною фіксатора. що обробка довгострокової культури лімфоцитів При необхідності осад зберігають у морозильній колцемідом (а не колхіцином) протягом 6-ти (а не камері при температурі - 20°С до моменту пригодвох) годин сприяють максимально можливій синтування препаратів метафазних хромосом. Для хронізації! культури і накопиченню клітин 5-го міто 5 15062 6 тичного розподілу, а додаткова обробка препаракороткотривалій (48год.) культурі лімфоцитів петів 50% оцтовою кислотою оптимізують розкид риферичної крові (на підставі цитогенетичного хромосом в метафазах, що дає можливість одераналіза 500 метафаз) 2,00±0,63 на 100 клітин; в жати необхідну для коректного цитогенетичного довготривалій культурі лімфоцитів (на підставі аналізу кількість якісних метафазних платівок. цитогенетичного аналіза 500 метафаз) - 5,20±0,99 Перевагою способу, на відміну від найближчий на 100 клітин. Різниця між результатами достовіраналога, є його економічність (не використовуютьна (Р0,05), що свідТ.44, №2.- С.146-150. чить про відсутність хромосомної нестабільності. 4. Рушковский С.Р., Безруков В.Ф., Бариляк Приклад 2 И.Р. Цитогенетическая нестабильность в лимфоПацієнт М. 14 років, з хронічним тиреоїдитом, цитах человека при краткосрочном и длительном народжений від батька з опроміненою радіойодом культивировании //Доклады НАН Украины. -1999. в 1986р. щитовидною залозою внаслідок Чорно№7. -С.173 -176. бильської аварії. Частота аберацій хромосом в Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601