Спосіб виділення m.tuberculosis із дослідного матеріалу хворих на туберкульоз легень

Спосіб виділення М. tuberculosis із дослідного матеріалу хворих на туберкульоз легень, що 3 64931 4 довищі Левенштейна-Єнсена, ріст колоній стає бактерій і їх наступному рості концентрація кисню помітним через великий проміжок часу - до 8 тижв середовищі зменшується, що викликає флюоренів, особливо якщо в дослідному матеріалі міссценцію та подальше її посилення. Флюоресценція титься невелика кількість мікобактерій; стає видимою при опроміненні пробірки ультрафі- бактерицидний барвник малахітовий зелений олетовим світлом і автоматично реєструється фов концентрації 2,0 % пригнічує ріст малої кількості тодатчиками, які вмонтовані в прилад ВАСТЕС М. tuberculosis, що призводить до зменшення кіль960. Інтенсивність світіння прямо пропорційна рівкості позитивних результатів. ню витрати кисню і реєструється в одиницях росту В основу корисної моделі поставлена задача (GU - growth units). удосконалити спосіб виділення М. tuberculosis із Пробірки MGIT з рідким живильним середовидослідного матеріалу хворих на туберкульоз лещем Middlebrook 7H9, які підготовлені до інкубації гень шляхом використання удосконаленого щільта інокульовані попередньо обробленими зразканого живильного середовища, яке має підвищену ми дослідного матеріалу, встановлюють в автомачутливість, щодо росту М. tuberculosis та знижені тизовану систему ВАСТЕС 960. Посіви інкубують інгібуючі властивості щодо сторонньої мікрофлори, при температурі 37 °С, де пробірки проходять моза рахунок чого досягається підвищення відсотка ніторинг ступеня флюоресценції кожні 60 хв. Ріст виділення М. tuberculosis з дослідного матеріалу мікобактерій і інших бактерій викликає посилення хворих та скорочення терміну дослідження. флюоресценції. У випадку з М. tuberculosis проба Поставлена задача вирішується тим, що у вважається позитивною, якщо спостерігається способі виділення М. tuberculosis із дослідного близько 105-106 колонієутворюючих одиниць в 1,0 матеріалу хворих на туберкульоз легень, що мл середовища. Прилад оцінює пробу як негативвключає деконтамінацію мокротиння, посів в прону при відсутності росту протягом 6 тижнів (42 добірки MGIT з рідким живильним середовищем би). Middlebrook 7H9 і культивування їх в автоматизоПро появу позитивної пробірки прилад повідованій системі ВАСТЕС 960 з наступним субкультимляє появою червоної індикації на зовнішній паневуванням позитивних проб, які не містять кордлі відповідного блока, а також звуковим сигналом. фактора і негативних за результатами посіву на Рідина з "позитивної"" пробірки повинна бути кров'яний агар, на щільному середовищі Левеншвикористана для: посіву на кров'яний агар для тейна-Єнсена для отримання ізольованих колоній контролю контамінації, субкультивування на серемікобактерій, згідно з корисною моделлю, субкульдовищі Левенштейна-Єнсена; приготування мазків тивування вищезазначених позитивних проб здійдля виявлення наявності корд-фактора та підтвеснюють на щільному живильному середовищі, яке рдження кислотостійкості. містить L-аспарагінову кислоту та бактерицидний При наявності сумнівів у правильності негатибарвник малахітовий зелений в концентрації 0,25 вного результату (тобто мутність, зернистість і т. %. п.) також необхідно приготувати мазки для мікросПри проведенні доказових досліджень було копічного дослідження, зробити посів матеріалу застосовано автоматизовану систему ВАСТЕС для наступного субкультивування на середовищі 960, яка дозволяє використовувати для роботи Левенштейна-Єнсена і на кров'яний агар для контрідке живильне середовище Middlebrook 7H9 та ролю контамінації. Якщо результати мікроскопії призначена для прискореної бактеріологічної діагмазків залишаються негативними, контамінація ностики туберкульозу і визначення чутливості мівідсутня і росту на середовищі Левенштейнакобактерій до антимікобактеріальних препаратів. Єнсена немає протягом 8 тижнів, видається негаДія системи заснована на реєстрації флюоресцентивна відповідь. ції, що виникає в пробірці при поглинанні зростаюВ процесі роботи щодо розробки способу вичими мікобактеріями кисню із рідкого живильного ділення М. tuberculosis з дослідного матеріалу середовища. Флюорохром, що запаяний у силікон, хворих було проведено дослідження 281 проби утримується на дні пробірки. Спочатку концентра(пробірки MGIT), що були позитивними в автомація кисню в рідкому живильному середовищі тизованій системі ВАСТЕС 960. Результати досліMiddlebrook 7H9 є досить великою, цей факт виджень наведені в табл. 1. кликає гасіння флюоресценції. При наявності мікоТаблиця 1 Результати досліджень культур мікобактерій, що були позитивними в автоматизованій системі ВАСТЕС 960 Позитивні культури в автоматизованій системі ВАСТЕС 960 Культури з наявністю корд-фактора і відсутністю росту на кров'яному агарі Культури без корд-фактора і відсутністю росту на кров'яному агарі Всього позитивних культур в системі ВАСТЕС 960 Кількість позитивних культур Абс. % 239 85,1±2,1 42 281 14,9±2,1 100 5 64931 Як видно з табл. 1 в 281 випадках було виявлено позитивний результат за інтенсивністю світіння при опроміненні ультрафіолетом в апараті ВАСТЕС 960. Інтенсивність світіння прямо пропорційна рівню витрати кисню і реєструється в одиницях росту, які не являються колонієутворюючими одиницями мікобактерій туберкульозу, а лише свідчать про інтенсивність поглинання кисню. Наявність корд-фактора є безперечним доказом наявності мікобактерій у пробірці MGIT, а відсутність росту на кров'яному агарі свідчить про те, що в позитивній пробірці на рідкому середовищі відсутні супутні мікроорганізми. Як видно з табл. 1 у 85,1 % випадків було констатовано присутність життєздатних мікобактерій, які росли в живильному середовищі і виявлялися за допомогою флюоресценції. Всі ці проби в подальшому були використані для постановки тесту медикаментозної стійкості. Як видно з табл. 1 при культивуванні в автоматизованій системі у 14,9 % випадків також були виявлені "позитивні" пробірки. В той же час додаткові дослідження показали відсутність кордфактора в цих пробірках MGIT, а також відсутність росту на кров'яному агарі. Таким чином, проведені дослідження показали, що в даних пробірках MGIT з рідким живильним середовищем немає супутньої мікрофлори, але ці культури поки не можуть вважатися позитивними на наявність життєздатних мікобактерій. Ми припустили, що пробірки MGIT, які були позитивними в апараті ВАСТЕС 960, не давали ріст на кров'яному агарі, тобто були вільними від супутньої мікрофлори, але були негативними за наявністю корд-фактора, можуть містити М. 6 tuberculosis, але в дуже малих кількостях з підвищеним обміном речовин, що і було зареєстровано апаратом ВАСТЕС 960 в одиницях росту. Також можна припустити, що пробірка MGIT може містити мікст-культури мікобактерій. У випадках, коли у пробі є в наявності більше одного виду мікобактерій з різною швидкістю росту, швидкоростучі мікобактерії можуть викликати позитивну флюоресценцію раніше ніж мікобактерії з повільним ростом. Враховуючи той факт, що позитивну пробірку MGIT неможливо повторно завантажити в систему ВАСТЕС 960, для продовження подальших досліджень всі пробірки з "позитивними" результатами на рідкому живильному середовищі після культивування в системі ВАСТЕС 960, але які не містили корд-фактора і були негативними за результатами посіву на кров'яний агар, розташовували в термостаті і інкубували 3 доби при 37 °С, тобто підрощували культуру. Якщо проби містять мікобактерії, інкубація в термостаті приведе до їх розмноження та в подальшому - до появи кордфактора при дослідженні методом світлової мікроскопії. Термін культивування пробірок MGIT в термостаті до появи корд-фактора був встановлений нами експериментально в такий спосіб. 42 пробірки MGIT з "позитивними" результатами на рідкому живильному середовищі після культивування в системі ВАСТЕС 960, але які не містили корд-фактора і були негативними за результатами посіву на кров'яний агар, інкубували в термостаті при 37 °С протягом 4 днів із визначенням наявності корд-фактора на 2-у, 3-ю і 4-у добу. Результати досліджень представлено в табл. 2. Таблиця 2 Залежність появи корд-фактора від терміну культивування позитивних пробірок MGIT Виявлення корд-фактора після інкубації на добу Матеріал Кількість досліджень другу третю четверту Абс. Позитивні пробірки MGIT за одиницями росту (GU) 42 % Абс. % Абс. % 3 7,1±3,9 7 16,7±2,3 9 21,4±6,3 Як видно з даних табл. 2, за чотири доби в 45,2 % випадків спостерігається поява кордфактора при інкубації позитивних пробірок MGIT в термостаті при 37 °С. При цьому саме на 4-ту добу більшість позитивних культур набувала корд-фактор - 21,4 %. Нас не цікавила поява корд-фактора з 5-ої доби інкубації, тому що за стандартною методикою, позитивна пробірка, яка була вилучена з автоматизованої системи ВАСТЕС 960 понад 5-ти діб, стає непридатною для проведення тесту медикаментозної чутливості в системі MGIT, в таких випадках її необхідно субкультивувати, тобто провести повторне культивування в автоматизованій системі ВАСТЕС 960. Отже втрачається значення самого методу інку Наявність кордфактора після інкубації Абс. % 19 45,2±7,6 бації в автоматизованій системі як експресметоду. Після інкубації протягом 4 діб залишилось 54,8 % проб, які були визначені системою MGIT як "позитивні", але, які не набули корд-фактора. Ці пробірки в подальшому використовували для субкультивування на середовищі ЛевенштейнаЄнсена, переглядали ці посіви протягом 8 тижнів і лише після цього у випадку відсутності росту, видавали негативну відповідь в клініку. Як відзначалося вище, посилення флюоресценції спостерігається лише при рості мікроорганізмів і інтенсивність світіння прямо пропорційна рівню витрати кисню та реєструється в одиницях росту, але в момент "позитивної"" відповіді сис 7 64931 8 теми не завжди кількість одиниць росту є достатном витримують в термостаті 1-2 год. Краще виньою для реєстрації росту мікобактерій. Лише користовувати цей розчин ex tempore, щоб уникпри наявності 105-106 колонієутворюючих одинути появи осаду в процесі зберігання. ниць в 1,0 мл середовища буде "позитивна" відЗа загальноприйнятою методикою готують повідь при мікроскопії (наявність корд-фактора). гомогенізат цільних яєць. Якщо використовувати загальноприйняту метоСередовище Левенштейна-Єнсена має надику і такий матеріал при субкультивуванні засіступний склад: розчин мінеральних солей - 600 вати на щільне середовище Левенштейнамл, розчин малахітового зеленого - 20 мл, гомоЄнсена при невеликій кількості мікобактерій прогенізовані яйця 20-25 штук, залежно від розміру) тягом тривалого часу ми можемо не отримати до 1000 мл. Готове живильне середовище розлиріст колоній. Таким чином, доцільно використовувають в пробірки по 5,0 мл і згортується в похивати не середовище Левенштейна-Єнсена, а лому положенні при температурі 85 °С протягом щільне середовище зі зниженою концентрацією 45 хв. бактерицидного барвника малахітового зеленого Таким чином, кінцева концентрація малахітоі спробувати виділити мікобактерії. В цьому навого зеленого в середовищі Левенштейна-Єнсена прямку була проведена наступна робота. - 2,0 %. Цей інгредієнт проявляє бактерицидну Ми спробували запропонувати таке щільне дію на супутню мікрофлору, яка міститься у зразсередовище, яке могло б використовуватися для ках дослідного матеріалу при посіві їх на середоотримання росту культур мікобактерій при субкувище Левенштейна-Єнсена для виділення збудльтивуванні "позитивних" пробірок MGIT після ника туберкульозу, оскільки деконтамінація автоматизованої системи ВАСТЕС 960, але які не деяких дуже забруднених зразків клінічного мамістять корд-фактора і являються негативними за теріалу при проведенні передпосівної обробки не результатами посіву на кров'яний агар. може повністю інгібувати ріст неспецифічної мікДля виділення культур мікобактерій викорисрофлори. товують класичне середовище ЛевенштейнаОскільки наші подальші дослідження були Єнсена. спрямовані на отримання культур МБТ з позитивЗгідно з рекомендацій Міжнародного союзу них зразків після культивування в автоматизовапо боротьбі з туберкульозом і хворобами легень ній системі ВАСТЕС 960, і які були негативними для практичних лабораторій краще використовуза наявністю корд-фактора та за результатами вати середовище, яке є модифікованим (див. посіву на кров'яний агар, тобто які не містили Культуральное исследование [Текст]: часть III / супутньої бактеріальної флори, ми припустили, Isabel Narvaiz de Kantor [et al.]; Лабораторная що зниження концентрації малахітового зеленого служба в программах по борьбе с туберкулезом ; в середовищі Левенштейна-Єнсена при субкульВОЗ. - Женева : ВОЗ, 1998. - 95 с.). Його вміст тивуванні позитивних пробірок MGIT буде сприянаступний: ти інтенсивному росту колоній МБТ та прискорить Інгредієнти процес їх субкультивування на щільному середоСуха основа: фосфат калію однозаміщений, вищі. безводний (KН2РО4) - 2,4 г, сульфат магнію - 0,24 Метою нашого дослідження було дослідити г, цитрат магнію - 0,6 г, L-аспарагін - 3,6 г, гліценайменшу концентрацію малахітового зеленого, рин (чистий) - 12,0 мл, дистильована вода - 600 при якій зберігається інгібуюча дія щодо росту мл. неспецифічної мікрофлори. Для цього нами було Всі інгредієнти розчиняють в дистильованій приготовлено щільне середовище Левенштейнаводі при нагріванні. Отриманий розчин стериліЄнсена в чашках Петрі з різними концентраціями зують автоклавуванням при 121 °С протягом 30 малахітового зеленого: 2,0 %, 1,0 %, 0,5 %, 0,25 хв. Отриманий розчин охолоджується до кімнат%, 0,2 %, 0,1 %. Інокуляцію середовища провоної температури і зберігається в холодильнику. дили культурою Candida albicans № 755. Готува8 Окремо готують 2,0 % розчин малахітового ли суспензію з концентрацією 1,5  10 бактеріазеленого наступного складу: малахітовий зелельних клітин в 1,0 мл, тобто 0,5 McF. Інкубацію ний (порошок) - 2,0 г, стерильна дистильована посівів здійснювали в термостаті при 37 °С, перевода - 100 мл. глядали щодня. Результати досліджень наведені Порошок малахітового зеленого розчиняють в табл. 3. в дистильованій стерильній воді, флакон з розчиТаблиця 3 Інгібуюча дія середовища Левенштейна-Єнсена з різними концентраціями малахітового зеленого щодо неспецифічної мікрофлори; n = 24 Концентрація малахітового зеленого в середовищі Левенштейна-Єнсена, % 2,0 1,0 0,5 0,25 0,2 0,1 Інтенсивність росту штаму Candida albicans № 755 на середовищі Левенштейна-Єнсена ріст відсутній ріст відсутній ріст відсутній ріст відсутній 8,0±1,4 15,0±1,7 9 З табл. 3 видно, що середовище Левенштейна-Єнсена з концентрацією малахітового зеленого від 2,0 % до 0,25 % мало інгібуючу дію щодо штаму Candida albicans № 755. Зменшення концентрації даного реактиву в середовищі до 0,2 % і нижче приводило до росту штаму Candida albicans, тобто в таких концентраціях бактерицидна дія середовища ЛевенштейнаЄнсена по відношенню до супутньої мікрофлори припинялась. Наші дослідження показали, що 0,25 % концентрація малахітового зеленого є найменшою концентрацією даного реагенту в середовищі Левенштейна-Єнсена, при якій зберігається його інгібуюча дія щодо росту неспецифічної мікрофлори. Подальші наші дослідження були спрямовані на вивчення залежності інтенсивності росту збудника туберкульозу на середовищі ЛевенштейнаЄнсена від концентрації малахітового зеленого, якій є одним з інгредієнтів середовища. Нами було проведено дослідження щодо зниження концентрації даного реагенту для отримання позитивної культури МБТ. Ми виходили з того, що 64931 10 при посіві 0,1 мл суспензії, яка містить 3000 клітин М. tuberculosis H37RV на середовище Левенштейна-Єнсена з 2,0 % концентрацією малахітового зеленого, виростає в середньому 25-30 колоній МБТ. Враховуючи цей факт, а також можливість росту неспецифічної мікрофлори при концентрації малахітового зеленого від 0,2 % і нижче, ми обмежились вивченням наступних концентрацій малахітового зеленого, який був внесений в середовище Левенштейна-Єнсена: 2,0 %; 1,0 %; 0,5 %; 0,25 %. В кожну чашку вносили по 0,1 мл суспензії МБТ із розведенням 3  3 10 . Результати досліджень наведені в табл. 4. Як видно з даних табл. 4, найбільша кількість колоній МБТ - в середньому 28,1, спостерігалась при посіві 0,1 мл суспензії, яка містила 3000 бактеріальних клітин штаму H37RV на середовище Левенштейна-Єнсена з 0,25 % концентрацією малахітового зеленого. На середовищі, що містить малахітовий зелений в концентрації 2,0 % інтенсивність росту колоній МБТ була в 2 рази нижче, ніж у попередньому досліджені. Таблиця 4 Залежність інтенсивності росту М. tuberculosis на середовищі Левенштейна-Єнсена з різними концентраціями малахітового зеленого; n = 24 Концентрація малахітового зеленого в середовищі Левенштейна-Єнсена 2,0 % 1,0% 0,5 % 0,25 % Середня кількість колоній М. tuberculosis, що виросли в чашках Петрі: 14,0±1,7* 19,0±1,9* 25,0±2,2* 28,1±2,4 Примітка. * - пряма висока кореляція між показниками концентрації малахітового зеленого r = 0,74; р < 0,001 та середньою кількістю колоній МБТ. Важливо також відмітити, що додавання в середовище Левенштейна-Єнсена малахітового зеленого в концентрації 1,0 % та 0,5 % хоча й призводило до поступового збільшення інтенсивності росту колоній МБТ на середовищі Левенштейна-Єнсена в середньому до 19 та 25 колоній, але було значно менше, ніж на середовищі з концентрацією малахітового зеленого 0,25 %. Таким чином, при порівнянні показників середньої кількості колоній М. tuberculosis, що виросли в чашках Петрі при різних концентраціях малахітового зеленого в середовищі Левенштейна-Єнсена, виявлено, що при концентрації малахітового зеленого 0,25 % виросла найбільша кількість колоній (між показниками існує пряма висока кореляція r = 0,74; р < 0,001). Враховуючи отримані результати досліджень, доцільним є використання середовища Левенштейна-Єнсена з концентрацією малахітового зеленого 0,25 % для субкультивування позитивних пробірок MGIT, які не давали ріст на кров'яному агарі, тобто були вільними від супутньої мікрофлори та були негативними за наявністю корд-фактора. В подальших дослідженнях нами була звернена увага на одну із складових класичного живильного середовища Левенштейна-Єнсена амінокислоту L-аспарагін. В проведених нами дослідженнях доведено, що заміна L-аспарагіна на L-аспарагінову кислоту абсолютно не знижує ростові здібності середовища. Однак, звертає увагу, той факт, що L-аспарагінова кислота в 2,6 рази дешевше L-аспарагіну. Нами було проведено декілька експериментів. Було приготовлено дві серії середовища Левенштейна-Єнсена, але без малахітового зеленого, яке було розлито в чашки Петрі. Середовище згортувалось в апараті при температурі 85 °С протягом 45 хв. В першій серії досліджень до складу середовища була внесена амінокислота L-аспарагін у кількості 3,6 г на 600 мл дистильованої води, у другій серії - L-аспарагін був замінений на Lаспарагінову кислоту в аналогічній кількості. Як тест-культуру було використано стандартний штам М. tuberculosis H37RV. З 14-добової ку 11 64931 12 3 льтури М. tuberculosis H37RV готували суспензію із 0,1 мл бактеріальної суспензії з розведень 10 6 8 10 . Посіви інкубували в термостаті при 37 °С до вмістом бактеріальних клітин 1 McF (3  10 кліпояви колоній М. tuberculosis. Щодня переглядатин/мл ізотонічного розчину хлориду натрію). Поли посіви, при появі росту визначали кількість тім готували розведення бактеріальної суспензії: 3 4 5 6 колоній МБТ. Результати досліджень наведено в 10 , 10 , 10 , 10 . В чашки Петрі з приготовленим табл. 5. середовищем Левенштейна-Єнсена засівали по Таблиця 5 Залежність інтенсивності росту М. tuberculosis H37RV від різних концентрації L-аспарагіну і L-аспарагінової кислоти в середовищі Левенштейна-Єнсена; n = 24 Середовище Левенштейна-Єнсена з Розведення бактеріальної суспензії М. малахітовим зеленим в концентрації tuberculosis H37RV, які були досліджені, 0,25 % та: клітин/мл 3 310 4 310 L-аспарагіном 5 310 6 310 3 310 4 310 L-аспарагіновою кислотою 5 310 6 310 Інтенсивність росту М. tuberculosis H37RV, кількість колоній МБТ 24,6±1,4* 2+ 4+ 4+ 29,7±1,5 2+ 4+ 4+ Примітки: 1. 2+ - ріст 100-200 колоній М. tuberculosis. 2. 4+ - ріст понад 500 колоній М. tuberculosis. 3. * - р < 0,001, t = 2,55 при порівнянні інтенсивності росту М. tuberculosis H 37RV на середовищі Левенштейна-Єнсена з L-аспарагіном та L-аспарагіновою кислотою. Як видно з даних табл. 5, при посіві на середовище Левенштейна-Єнсена з 0,25 % концентрацією малахітового зеленого та з L-аспарагіном при посіві 0,1 мл суспензії, яка містить 3000 клітин М. tuberculosis H37RV виросло в середньому 24,6±10,3 колоній МБТ, при посіві на середовище Левенштейна-Єнсена з 0,25 % концентрацією малахітового зеленого та з L-аспарагіновою кислотою такої же кількості мікробних клітин виросло у середньому 29,7 колоній МБТ, що на 5,1 % більше (р 2,0. Враховуючи цей показник, а також той факт, що L-аспарагінова кислота в 2,6 дешевше L-аспарагіну, доцільно в нашому дослідженні додавати в середовище Левенштейна-Єнсена Lаспарагінову кислоту. Надалі нас цікавив вплив кількості внесеної в середовище L-аспарагінової кислоти на ріст М. tuberculosis. Було випробувано 3 концентрації Lаспарагінової кислоти: 2,0 г, 3,6 г і 5,2 г, які були внесені в середовищі Левенштейна-Єнсена з 0,25 % концентрацією малахітового зеленого. Як тест-культуру використовували стандартний штам М. tuberculosis H37RV 3 14-добової культури М. tuberculosis H37RV готували суспензію з 3 вмістом бактеріальних клітин 310 клітин/мл ізотонічного розчину хлориду натрію. В середовище Левенштейна-Єнсена з різним вмістом Lаспарагінової кислоти засівали по 0,1 мл отриманої суспензії. Посіви інкубували в термостаті при 37 °С до появи колоній М. tuberculosis. Щодня переглядали посіви, при появі росту визначали кількість колоній МБТ. Результати досліджень, що були отримані, наведено в табл. 6. 13 64931 14 Таблиця 6 Залежність інтенсивності росту М. tuberculosis H37RV в середовищі Левенштейна-Єнсена з 0,25 % концентрацією малахітового зеленого від різних концентрацій L-аспарагінової кислоти; n = 24 Розведення бактеріальної суІнтенсивність росту М. Середовище Левенштейна-Єнсена з 0,25 % спензії М. tuberculosis H37RV, які tuberculosis H37RV, кількість концентрацією малахітового зеленого та з: були досліджені, клітин/мл колоній МБТ 3 L-аспарагіновою кислотою (2,0 г) 20,2±1,3* 310 3 L-аспарагіновою кислотою (3,6 г) 29,7±1,6 310 3 L-аспарагіновою кислотою (5,2 г) 310 29,4±1,6 Примітки: 1. * - р 0,001, t = 0,13 при порівнянні показників росту М. tuberculosis H 37RV на середовищі з 3,6 г і 5,2 г L-аспарагінової кислоти. Як видно з даних табл. 6, найбільш інтенсивним ріст МБТ - 29,7 колоній МБТ, спостерігався при посіві 0,1 мл суспензії, яка містила 3000 клітин М. tuberculosis H37RV, на середовище Левенштейна-Єнсена з 0,25 % концентрацією малахітового зеленого та з L-аспарагіновою кислотою в кількості 3,6 г; при внесенні в середовище Левенштейна-Єнсена L-аспарагінової кислоти в кількості 2,0 г виросло в середньому 20,2 мікробних клітин МБТ, що в 1,4 рази було нижче, ніж при попередньому дослідженні (р 2,0. Збільшення концентрації L-аспарагінової кислоти до 5,2 г не приводило до підвищення інтенсивності росту М. tuberculosis H37RV (р > 0,001, t = 0,13). Різниця показників не суттєва, статистично не доказана, тому що t < 2,0. Враховуючи вищевикладене, оптимальним є 3,6 г L-аспарагінової кислоти, що містить середовище Левенштейна-Єнсена. Спосіб здійснюють таким чином. Проводять деконтамінацію, розрідження і концентрацію мікобактерій у мокротинні згідно методичних рекомендацій (див. Застосування автоматизованої системи MGIT для діагностики туберкульозу легень і визначення медикаментозної стійкості мікобактерій [Текст] : метод, рекомендації / Барбова А. І. [та ін.] ; ДУ "Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф. Г. Яновського АМН України". - Київ : ІФП, 2007. - 24 с.). На наступному етапі для одержання первинної культури мікобактерій в рідкому середовищі за допомогою системи MGIT проводять підготовку пробірки MGIT до посіву з попереднім розведенням PANTA (добавка з антибіотиками для пригнічення росту сторонньої мікрофлори), тобто здійснюють внесення в пробірку MGIT концентрованого деконтамінуючого матеріалу, а потім інокуляцію дослідного матеріалу. Інкубацію пробірок здійснюють в системі MGIT. Про позитивні результати (тобто про початок росту мікобактерій у пробірках) прилад повідомляє появою зеленої індикації. Рідину з позитивної пробірки використовують для приготування мазків для визначення наявно сті корд-фактора і посіву на кров'яний агар для контролю контамінації. Якщо результати мікроскопії матеріалу із пробірки, відзначеної як позитивна системою MGIT є негативними, а середовище прозоре і немає інших підозр на контамінацію, то на наступному етапі поміщають пробірку MGIT в термостат для наступного моніторингу і повторюють відбір матеріалу для мазків і мікроскопію протягом 4 діб та здійснюють посів позитивних проб, які не містять корд-фактора і негативних за результатами посіву на кров'яний агар, на щільне живильне середовище, яке містить Lаспарагінову кислоту і бактерицидний барвник малахітовий зелений в концентрації 0,25 % та здійснюють інкубацію в термостаті протягом 3-х тижнів при 37 °С, після чого видають остаточну відповідь на наявність мікобактерій в дослідженому матеріалі. Якщо результати мікроскопії мазків стають позитивними, або виявляється ріст мікобактерій на щільному живильному середовищі з Lаспарагіновою кислотою і з 0,25 % концентрацією малахітового зеленого, при цьому контамінація відсутня, то здійснюють постановку тесту медикаментозної чутливості і видають позитивну відповідь. Якщо результати мікроскопії мазків залишаються негативними, контамінація відсутня і росту на щільному живильному середовищі немає протягом 3 тижнів, видають негативну відповідь. Наводимо конкретний приклад здійснення способу. Приклад. Дослідження мокротиння хворого М., історія хвороби № 3965, був прийнятий до 3-го терапевтичного відділення інституту з діагнозом ВДТБ (06.07.2010), обох легень, інфільтративний, М+, К+, Рез 0. Проводять деконтамінацію, розрідження і концентрацію мікобактерій у мокротинні згідно з методичними рекомендаціями (див. Застосування автоматизованої системи MGIT для діагностики туберкульозу легень і визначення медикаментозної стійкості мікобактерій [Текст] : метод, 15 64931 16 рекомендації / Барбова А. І. [та ін.] ; ДУ "Інститут Таким чином, в процесі роботи щодо розробфтизіатрії і пульмонології ім. Ф. Г. Яновського ки способу виділення М. tuberculosis з дослідного АМН України". - Київ : ІФП, 2007. - 24 с.). матеріалу хворих було проведено дослідження На наступному етапі для одержання первин281 проби (пробірки MGIT), що були позитивними ної культури мікобактерій в рідкому середовищі після культивування в автоматизованій системі за допомогою системи MGIT проводять підготовВАСТЕС 960. З них в 239 пробах було виявлено ку пробірки MGIT до посіву з попереднім розвенаявність корд-фактора і відсутність росту на денням PANTA (добавка з антибіотиками для кров'яному агарі, тобто в 239 пробах було виявпригнічення росту сторонньої мікрофлори), тобто лено М. tuberculosis. 42 проби (14,9 %) автоматиздійснюють внесення в пробірку MGIT концентзованою системою були ідентифіковані як позированого деконтамінуючого матеріалу, а потім тивні, але не мали корд-фактора, і були інокуляцію дослідного матеріалу. негативними за результатами посіву на кров'яний Пробірку MGIT з дослідним матеріалом поагар, тобто не були контаміновані сторонньою міщаємо в автоматизовану систему ВАСТЕС 960, мікрофлорою. Для проведення ідентифікації ці 42 інкубуємо. проби були поміщені у термостат. Після 4-х доЧерез декілька діб прилад повідомив появою бової інкубації в термостаті 19 проб дали ріст М. зеленої індикації про початок росту мікобактерій у tuberculosis. Інші 23 проби, які були позитивними пробірці. Рідину з "позитивної" пробірки викорисв автоматизованій системі ВАСТЕС 960, але не товуємо для приготування мазків з метою визнадали ріст в термостаті, в подальшому використочення наявності корд-фактора і для посіву на вували для субкультивування на середовищі Лекров'яний агар для контролю контамінації. венштейна-Єнсена. Протягом 10 тижнів посіви Виявилося, що результати мікроскопії матепереглядали і у випадку відсутності росту, видаріалу із пробірки хворого К., відзначеної як "позивали негативну відповідь в клініку (згідно стандативна" системою MGIT, є негативні, а середовиртної методики). Паралельно проводили субкульще було прозоре і не мало інших підозр на тивування 23 вищезазначених проб контамінацію. Пробірка MGIT була поміщена в запропонованим способом з використанням удотермостат. Але перед цим для виключення консконаленого щільного живильного середовища, тамінації був здійснений висів дослідного матеріяке містить L-аспарагінову кислоти і 0,25 % коналу на кров'яний агар. Через добу встановлено, центрацію малахітового зеленого з наступною що матеріал хворого К. в пробірці MGIT не місінкубацією в термостаті протягом 3-х тижнів. Витить супутньої мікрофлори. користання запропонованого способу дозволило З поміщеної пробірки MGIT в термостат повиділити ще 11 культур М. tuberculosis, що на 3,9 вторювали відбір матеріалу для мазків на мікрос% більше, ніж за стандартною методикою, тоді як копію протягом 4 діб, але не отримали наявності субкультивування на стандартному середовищі корд-фактора. Левенштейна-Єнсена не дало ріст в жодному Тому через 4 доби з метою субкультивування випадку. було проведено висів дослідного матеріалу на Таким чином, проведені дослідження довели, щільне живильне середовище Левенштейнащо при використанні удосконаленого щільного Єнсена з L-аспарагіновою кислотою і з 0,25 % живильного середовища для отримання ізольоконцентрацією бактерицидного барвника малахіваних колоній мікобактерій, яке має підвищену тового зеленого з наступною інкубацією в термочутливість, щодо росту М. tuberculosis та знижені статі протягом 3-х тижнів. інгібуючі властивості щодо сторонньої мікрофлоЧерез 2 тижні було виявлено ріст мікрооргари, досягається підвищення відсотка виділення нізмів на цьому середовищі. Проведена традиМ. tuberculosis з дослідного матеріалу хворих та ційна рутинна ідентифікація показала, що виявскорочення терміну дослідження. лені мікроорганізми є мікобактерії туберкульозу. Спосіб, що пропонується, може знайти широЦі колонії мікобактерій туберкульозу були викоке застосування в бактеріологічних лабораторіях ристані для постановки тесту медикаментозної протитуберкульозних закладів і є розробкою найчутливості, а у відділення надійшла відповідь, що більш інформативної діагностичної технології, у хворого К. з мокротиння виділені мікобактерії спрямованої на виділення М. tuberculosis із оргатуберкульозу. нізму хворих на туберкульоз легень. Комп’ютерна верстка М. Мацело Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601