Спосіб запліднення in vitro

1. Спосіб запліднення in vitro, що включає проведення попереднього відбору незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, який відрізняється тим, що відбирають незрілі ооцити на стадії GV і/або М1, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у композицію для культивування додають людський альбумін (Human Serum Albumin "SAGE Media") кількістю 10-20 мг/мл. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що після U 2 (19) 1 3 У програмах лікування безплідності методами ДРТ дозрівання більшої кількості ооцитів індукують підвищеними дозами гонадотропних гормонів. Багато пацієнток мають порушення в ендокринній системі, страждають синдромом полікістозних яєчників. Ці фактори є причиною аномальної надекспресії в ході оогенезу деяких генів і зайвого нагромадження їх мРНК у цитоплазмі ооцита. За даними різних центрів ЕКЗ частота настання вагітності після застосування методу ЕКЗ перебуває в межах 20-40 %. Тому дуже актуальний пошук нових шляхів, які б привели до підвищення ефективності програм ДРТ. Один з напрямків для рішенням даної проблеми складається в поліпшенні якості ооцитів. З рівня медицини відомий спосіб запліднення in vitro (US 6641526, А 61 У 17/43, опублікований 04.11.2003), у якому при заплідненні як допоміжна процедура для підвищення якості ооцитів в ооцит за допомогою ін'єкцій уводять антизначеннєві екзогенні нуклеїнові кислоти в складі генетичних конструкцій, а потім проводять ембріотрансплантацію. Досягненню необхідного технічного результату в зазначеному винаході перешкоджає ушкодження мембрани ооцита в результаті проведення операції ін'єкції, що призводить до подальшого погіршення якості ооцита і ембріона. Крім того, введення в ооцит ін'єкцією антизначеннєвих екзогенних нуклеїнових кислот забезпечує тільки їх локальний і короткостроковий доступ у клітину, також введення екзогенних нуклеїнових кислот у складі генетичної конструкції може призвести до модифікації генома ембріона. Відомий також спосіб підвищення ефективності запліднення ооцитів (US 5693534, С12N 5/00, опубл. 02.12.1997), що включає відбір ооцита, введення його в композицію для культивування, культивування ооцита в композиції, запліднення культивованого ооцита сперматозоїдами, культивування ембріона в композиції і ембріотрансплантацію, при цьому застосовували композицію, що містить щонайменше 0,01 нг/мол активіну і щонайменше 0,01 нг/мол інгібіну або застосовували композицію з додаванням пептидів, що містить щонайменше 0,01 нг/мол активіну і щонайменше 0,01 нг/мол інгібіну, тобто композиція включає тільки послідовності амінокислот. Найбільш близьким аналогом, прийнятим нами за прототип, є спосіб запліднення in vitro шляхом керування якістю ооцитів (патент РФ №2281777, МПК А61К35/54 (2006.01), C12N5/08 (2006.01), А61Р43/00 (2006.01), опубл. 20.08.2006), згідно з яким попередньо проводять відбір і видалення незрілих ооцитів, розміщення щонайменше одного ооцита в культуральному середовищі і культивування, при цьому в культуральне середовище додають ефективну кількість щонайменше одного антизначеннєвого олігонуклеотиду довжиною 17-30 нк, кожний з яких комплементарний мРНК щонайменше одного з наступних генів: генів індукторів апоптоза, таких як HRK, FAS, FASL, BAX, Caspasa-3, генів ростових факторів, таких як IGF1, генів рецепторів ростових факторів, таких як IGF1R, генів регулюючих темпи дроблення ембрі 65889 4 онів, таких як HLA-E, HLA-F, HLA-G генів клітинного стресу, таких як HSF1 і HSF2. Композиція для додавання в культуральне середовище включає один або більше антизначеннєвих олігонуклеотидів, описаних вище, і прийнятний розчинник. Перевага винаходу полягає в підвищенні якості і життєздатності ооцитів і підвищенні терапевтичної ефективності лікування безплідності. Недоліком описаного способу є недостатня якість отриманих ооцитів, а також недостатня терапевтична ефективність лікування безплідності, особливо у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, що нерідко призводить до використання програм з донорськими ооцитами. Як показали наші дослідження, причинами цього є ряд порушень у більшості проблемних (неякісних) зрілих ооцитів М2, які негативно впливали на подальший розвиток ембріона: — цитоплазма ооцитів була поганої консистенції, мутнувата, гранульована, зустрічались гранульозні скупчення; — якісні характеристики цитоплазматичної мембрани були дуже низькі: погана еластичність, підвищена травматичність. Задачею, на вирішення якого спрямований даний винахід, є створення способу підвищення якості ооцитів, зменшення кількості введених препаратів і їхнього негативного впливу для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій), можливість отримання вагітності із власного генетичного матеріалу не використовуючи донорські ооцити у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, відповідно зменшення кількості програм з донорськими ооцитами. Для вирішення цієї задачі у способі запліднення in vitro, згідно з яким, попередньо проводять відбір незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, згідно з корисною моделлю, відбирають незрілі ооцити на стадії GV і /або М1, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2, при найкращих варіантах реалізації пропонованого способу у композицію для культивування додають людський альбумін (Human Serum Albumin "SAGE Media") у кількості (10-20) мг/мл; після відбору незрілих ооцитів визначають консистенцію цитоплазми та якісні характеристики цитоплазматичної мембрани; дорощування незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 здійснюють упродовж 24-40 годин; ооцити після культивування піддають кріоконсервації; використовують композицію для культивування, яка містить: D-глюкозу, динатрієву сіль, гентаміцин, гліцин, кальцію лактат, L-аланін, Lаспарагінову кислоту, L-аспарагін моногідрат, Lглутамінову кислоту, L-глутамін, L-пролін, L-серин, L-таурин, магнію сульфат, калію дигідроортофосфат; відбір ооцитів здійснюють трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні ними розміру 18 5 20 мм на 14-15-й день циклу. Вибір конкретного варіанта реалізації пропонованого способу залежить від вихідного стану жінки та результатів медичного обстеження. В основу даної корисної моделі покладено той факт, що в результаті наших досліджень було встановлено, що дорощені в лабораторних умовах in vitro незрілі ооцити за основними якісними характеристиками не поступались зрілим яйцеклітинам, більш того, у випадках, коли ми отримували зрілі ооцити поганої якості, незрілі GV і /або М1яйцеклітини однієї і тієї ж самої пацієнтки, після дорощування були значно кращої якості (навіть у жінок старшого віку та з проблемами формування повноцінних ооцитів in vivo (в організмі жінки)). Оскільки у деяких пацієнток старшої вікової групи відмічається несинхронний ріст фолікулів під час стимуляції індукторами овуляції у програмах ДРТ ввівши тригер овуляції на розмірі максимального фолікула 18-20 мм, ми мали змогу отримати ооцити різного ступеня зрілості (GV, M1, M2). Причому кількість GV - клітин іноді дорівнювала кількості зрілих ооцитів. Це і спонукало нас здійснювати дорощування незрілих ооцитів (GV і /або М1) до стадії М2; причому в результаті ми отримали візуально кращі клітини, ніж зрілі в момент пункції. Таким чином переваги пропонованого способу від способу по прототипу такі: 1) Використовуючи незрілі GV і /або М1-ооцити ми отримуємо можливість вплинути на процес формування зрілого ооцита, що дасть нам змогу вносити певні якісні корективи в формування повноцінного зрілого ооцита М2. 2) Забір ооцитів на стадіях GV і /або М1 дозволяє зменшити кількість введених препаратів для стимулювання GV і /або М1-яйцеклітин оскільки саме ці клітини менш чутливі до негативного впливу препаратів, які використовуються для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій). 3) За рахунок використання даного способу жінки старшого віку, з низьким оваріальним резервом та з прогностично поганими ооцитами будуть мати змогу мати власних генетичних дітей, не використовуючи донорські ооцити. 4) Важливим є також те, що за рахунок використання пропонованого способу значно скоротиться кількість донорських програм, що є особливо важливим для країн Євросоюзу, де в більшості країн донація ооцитів заборонена, що є суттєвою проблемою для багатьох безплідних пар, яким рекомендована донація ооцитів. 5) Додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media") значною мірою покращує якість цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприяєтиме утворенню ембріонів кращої якості. Заявлений спосіб підтверджується наступними прикладами його здійснення Приклад 1. Пункцію фолікулів і відбір незрілих 65889 6 ооцитів на стадії GV і /або М1 серед загальної кількості яйцеклітин, більшість з яких перебуває на стадії М2 (стадія зрілого ооцита), здійснювали трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні ними розміру 18-20 мм на 14-15-й день циклу, після введення тригерної дози хоріогонічного гонадотропіну (для остаточного дозрівання ооцитів) за допомогою голки для аспірації ооцитів 17G (KOSN-1730-B-90 "COOK") із застосуванням внутрішньовенного наркозу. Тиск в аспіраційній системі знижували до 7,5 кПа. Після відмивання ооцитів (в середовищі Flushing Medium "MediCult") та їх денудації здійснювали відбір незрілих ооцитів на стадіях GV та М1 серед загальної кількості яйцеклітин, більшість з яких перебувало на стадії М2 стадії зрілого ооцита після чого незрілі яйцеклітини (GV та М1) поміщали в композицію для культивування IVM ("MediCult", Данія) на 28-40 ч. Потім незрілі яйцеклітини, які досягли стадії МІІ (зрілий ооцит), тобто ті, в яких з'явилось перше полярне тільце, запліднювали методом ICSI і через 16-20 год. оцінювали результати за фактом утворення зиготи (поява 2 пронуклеусів). З цієї стадії ембріони культивували в середовищі IVF ("MediCult") протягом 2 діб, після чого здійснювали ембріотрансплантацію (ембріотрансфер). Паралельно здійснювали підготовку ендометрія для його переходу в секреторну фазу; при недостатній динаміці наростання ендометрія чи відсутності структурних змін в ньому, починаючи з дня пункції призначали препарати естдгорогенів ("Прогонова", "Дівігель"). Діагностику вагітності проводили шляхом визначення в сироватці крові ХГ через 12-16 днів після перенесення ембріонів, а потім через 1-2 тижнів за допомогою УЗД підтверджували факт її настання, нормальний розвиток ембріонів і встановлювали їх локалізацію в матці. Достовірно встановлено, що дозрівання незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 відбувається в 5584 % випадках, запліднення в 67,9-90,7 %, отримання вагітності 23,3-38,5 %. Приклад 2. Умови конкретної реалізації способу аналогічні прикладу 1. Але у композицію для культивування з незрілими ооцитами додають людський альбумін (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media". Внаслідок реалізації пропонованого способу було спостережено наступне: - культивування незрілих ооцитів in vitro призвело до ряду позитивних фенотипічних, морфологічних та біохімічних змін: відбулось покращення якості цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита. - додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media"), значною мірою покращує якісні характеристик як цитоплазми, так і цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприяє утворенню ембріонів кращої якості. 7 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 65889 8 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601