Спосіб запліднення in vitro

1. Спосіб запліднення in vitro, що включає проведення попереднього відбору незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, який відрізняється тим, що відбирають всі ооцити в незрілому стані трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні ними розміру 10-13 мм на 8-12-й день циклу, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2. U 2 (19) 1 3 пошук нових шляхів, які б привели до підвищення ефективності програм ДРТ. Один з напрямків для рішенням даної проблеми складається в поліпшенні якості ооцитів. З рівня медицини відомий спосіб запліднення in vitro (US 6641526, А61Y 17/43, опублікований 04.11.2003), згідно з яким, при заплідненні як допоміжна процедура для підвищення якості ооцитів, в ооцит за допомогою ін'єкцій уводять антизначеннєві екзогенні нуклеїнові кислоти в складі генетичних конструкцій, а потім проводять ембріотрансплантацію. Досягненню необхідного медичного результату в зазначеному винаході перешкоджає ушкодження мембрани ооцита в результаті проведення операції ін'єкції, що призводить до подальшого погіршення якості ооцита і ембріона. Крім того, введення в ооцит ін'єкцією антизначеннєвих екзогенних нуклеїнових кислот забезпечує тільки їх локальний і короткостроковий доступ у клітину, також введення екзогенних нуклеїнових кислот у складі генетичної конструкції може призвести до модифікації генома ембріона. Відомий також спосіб підвищення ефективності запліднення ооцитів (US 5693534, С 12 N 5/00, опубл. 02.12.1997), що включає відбір ооцита, введення його в композицію для культивування, культивування ооцита в композиції, запліднення культивованого ооцита сперматозоїдами, культивування ембріона в композиції і ембріотрансплантацію, при цьому застосовували композицію, що містить, щонайменше, 0,01 нг/мол активіну і, щонайменше, 0,01 нг/мол інгібіну або застосовували композицію з додаванням пептидів, що містить, щонайменше, 0,01 нг/мол активіну і, щонайменше, 0,01 нг/мол інгібіну, тобто композиція включає тільки послідовності амінокислот. Найбільш близьким аналогом, прийнятим нами за прототип, є спосіб запліднення in vitro шляхом керування якістю ооцитів (патент РФ №2281777, МПК А61К 5/54 (2006.01), C12N 5/08 (2006.01), А61Р 43/00 (2006.01), опубл. 20.08.2006), згідно з яким попередньо проводять відбір і видалення незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, при цьому в культуральне середовище додають ефективну кількість, щонайменше, одного антизначеннєвого олігонуклеотиду довжиною 17-30 нк, кожний з яких комплементарний мРНК, щонайменше, одного з наступних генів: генів індукторів апоптоза, таких як HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-З, генів ростових факторів, таких як, IGF1, генів рецепторів ростових факторів, таких як IGF1R, генів регулюючих темпи дроблення ембріонів, таких як HLA-E, HLA-F, HLA-G генів клітинного стресу, таких як HSF1 і HSF2. Композиція для додавання в культуральне середовище включає один або більше антизначеннєвих олігонуклеотидів, описаних вище, і прийнятний розчинник. Перевага винаходу полягає в підвищенні якості і життєздатності ооцитів і підвищенні терапевтичної ефективності лікування безплідності. 65890 4 Недоліком описаного способу є недостатня якість отриманих ооцитів, а також недостатня терапевтична ефективність лікування безплідності, особливо у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, що нерідко призводить до використання програм з донорськими ооцитами. Як показали наші дослідження, причинами цього є ряд порушень у більшості проблемних (неякісних) зрілих ооцитів М2, які негативно впливали на подальший розвиток ембріона: - цитоплазма ооцитів була поганої консистенції, мутнувата, гранульована, зустрічались гранульозні скупчення; - якісні характеристики цитоплазматичної мембрани були дуже низькі: погана еластичність, підвищена травматичність. Задачею, на вирішення якої спрямований дана корисна модель, є підвищення якості ооцитів, зменшення кількості введених препаратів і їхнього негативного впливу для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій), можливість отримання вагітності із власного генетичного матеріалу, не використовуючи донорські ооцити у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, відповідно зменшення кількості програм з донорськими ооцитами. Для вирішення поставленої задачі у способі запліднення in vitro, згідно з яким попередньо проводять відбір незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, згідно з корисною моделлю, відбирають всі ооцити в незрілому стані трансвагінально під УЗконтролем, при досягненні ними розміру 10-13 мм на 8-12-й день циклу, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2, при найкращих варіантах реалізації пропонованого способу у композицію для культивування додають людський альбумін (Human Serum Albumin "SAGE Media") кількістю 10-20 мг/мл; після відбору незрілих ооцитів визначають консистенцію цитоплазми та якісні характеристики цитоплазматичної мембрани; дорощування незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 здійснюють упродовж 24-40 годин; ооцити після культивування піддають кріоконсервації; використовують композицію для культивування, яка містить: D-глюкозу, динатрієву сіль, гентаміцин, гліцин, кальцію лактат, L-аланін, Lаспарагінову кислоту, L-аспарагін моногідрат, Lглутамінову кислоту, L-глутамін, L-пролін, L-серин, L-таурин, магнію сульфат, калію дигідроортофосфат. Вибір конкретного варіанту реалізації пропонованого способу залежить від вихідного стану жінки та результатів медичного обстеження. В основу даної корисної моделі поставлено той факт, що в результаті наших досліджень було встановлено, що дорощені в лабораторних умовах in vitro незрілі ооцити відібрані в ті терміни, коли зрілі ооцити ще не з'явились, за основними якіс 5 ними характеристиками не поступались зрілим яйцеклітинам, більш того, у випадках, коли ми отримували зрілі ооцити поганої якості, незрілі GV і /або М1-яйцеклітини однієї і тієї ж самої пацієнтки, після дорощування були значно кращої якості (навіть у жінок старшого віку та з проблемами формування повноцінних ооцитів in vivo (в організмі жінки)). Таким чином переваги запропонованого способу від способу по прототипу такі: 1) Забір ооцитів на стадіях GV і /або М1 дозволяє зменшити кількість введених препаратів для стимулювання GV і /або М1-яйцеклітин, оскільки саме ці клітини менш чутливі до негативного впливу препаратів, які використовуються для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій). 2) Використовуючи незрілі GV і /або М1ооцити, ми отримуємо можливість вплинути на процес формування зрілого ооцита, що дасть нам змогу вносити певні якісні корективи в формування повноцінного зрілого ооцита М2. 3) За рахунок використання даного способу жінки старшого віку, з низьким оваріальним резервом та з прогностично поганими ооцитами будуть мати змогу мати власних генетичних дітей, не використовуючи донорські ооцити. 4) Важливим є також те, що за рахунок використання запропонованого способу значно скоротиться кількість донорських програм, що є особливо важливим для країн Євросоюзу, де в більшості країн донація ооцитів заборонена, що є суттєвою проблемою для багатьох безплідних пар, яким рекомендована донація ооцитів. 5) Додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media") в значній мірі покращує якість цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприятиме утворенню ембріонів кращої якості. Заявлений спосіб підтверджується наступними прикладами його здійснення. Приклад 1. Пункцію фолікулів і відбір незрілих ооцитів здійснювали трансвагінально під УЗконтролем, при досягненні ними розміру 10-13 мм на 8-12-й день циклу на стадії GV і /або М1, за допомогою голки для аспірації ооцитів 17G (KOSN-1730-B-90 "COOK") із застосуванням внутрішньовенного наркозу. Тиск в аспіраційній системі знижували до 7,5 кПа. Прагнули уникнути ситуації з домінантним фолікулом діаметром 14 мм і більше, оскільки в таких випадках можна очікувати атрезію інших фолікулів і неповноцінність ооцитів в них. Після відмивання ооцитів (в середовищі Flushing Medium "MediCult") здійснювали їхнє дозрівання, для чого їх поміщали в композицію для Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 65890 6 культивування IVM ("MediCult", Данія) на 28-40 ч. Потім яйцеклітини, які досягагли стадії МІІ, що встановлювали після їх денудації по наявності 1-го полярного тільця, запліднювали методом ICSI і через 16-20 год. оцінювали результати за фактом утворення зиготи (поява 2 пронуклеусів). З цієї стадії ембріони культивували в середовищі IVF ("MediCult") протягом 2 діб, після чого здійснювали ембріотрансплантацію. Ендометрій до моменту пункції фолікулів залишається на стадії проліферації і, як правило, за часом та морфологією відповідає лише її 9-12-го дням. Тобто він істотно відстає в досягненні преімплантаційного стану і з урахуванням відсутності найближчої перспективи секреторної трансформації достатньо далекий від виникнення в ньому умов необхідних для нідації. Для виходу з такого становища та забезпечення своєчасної підготовки слизової матки до імплантації перенесених ембріонів, що утворилися після дозрівання in vitro незрілих ооцитів на стадії GV і /або М1, слід призначати перорально естрадіол (прогінова) починаючи з дня пункції фолікулів, а з дня ICSI - прогестерон (утрожестан по 200 мг 3 рази на добу інтравагінально). Добова доза естрадіолу залежала від стану ендометрію, оцінюваного за допомогою УЗД. При його товщині 6 мм - 6 мг на добу. Така "замісна" терапія при настанні вагітності тривала 12-13 нед. Діагностику вагітності проводили шляхом визначення в сироватці крові ХГ через 12-16 днів після перенесення ембріонів, а потім через 1-2 тижнів з допомогою УЗД підтверджували факт її настання, нормальний розвиток ембріонів і встановлювали їх локалізацію в матці. Достовірно встановлено, що дозрівання незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 відбувається в 5584 % випадках, запліднення в 67,9-90,7 %, отримання вагітності 23,3-38,5 %. Приклад 2. Умови конкретної реалізації способу аналогічні прикладу 1. Але у композицію для культивування з незрілими ооцитами додають людський альбумін (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media". Внаслідок реалізації пропонованого способу було спостережено наступне: - культивування незрілих ооцитів in vitro призвело до ряду позитивних фенотипічних, морфологічних та біохімічних змін: відбулось покращення якості цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита. - додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media"), в значній мірі покращує якісні характеристик як цитоплазми, так і цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприяє утворенню ембріонів кращої якості. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601