Композиція для запліднення in vitro

1. Суха композиція, що включає речовину, яка активує мейоз (MAS), і добавку, у якій MAS вибрана з групи, що включає 4,4-диметил-5 a -холеста8,14,24-триєн-3 b -ол, гемісукцинат 4,4-диметил5 a -холеста-8,14,24-триєн-3 b -олу, 5 a -холест8,14-дієн-3 b -ол, гемісукцинат 5 a -холест-8,14 2 (19) 1 3 78183 4 утворення такої композиції, яка може бути викориту, заглиблення і порожнини є взаємно позначестана для приготування водного розчину, що місними як порожнини. Щонайменше одна з таких тить MAS. порожнин містить композицію відповідно до даного Прикладами добавок є водорозчинні білки, такі винаходу. Прийнятний спосіб розміщення сухої як сироватковий альбумін, наприклад сироваткокомпозиції MAS в порожнину включає спочатку вий альбумін людини (далі по тексту HSA), необовнесення розчину, що містить MAS і добавку, у в'язково у рекомбінантній формі, ферменти і фоспорожнину з подальшим випаровуванням розчину. фогліцериди, такі як, наприклад, У цьому способі залишок після випаровування, фосфа тидилетаноламін, фосфатидилхолін, фостобто композиція відповідно до даного винаходу, фатидилсерин, фосфатидилнозітол. розміщується безпосередньо в порожнині зазнаПереважно, коли композиції відповідно до даченого пристрою (системи доставки). Оскільки ного винаходу мають вміст води менше 10%, кракомпозицію відповідно до даного винаходу передще менше 5%, найкраще менше 1% (мас/мас). бачається застосовувати для обробки ооцитів, Переважно, коли композиції відповідно до даважливим фактором є те, щоб композиція не місного винаходу мають вміст органічного розчинника тила складових частин, які негативно впливають менше 10%, краще менше 5%, найкраще менше на ооцити. 1% (мас/мас). Один зі способів застосування композиції даПереважно, коли композиції відповідно до даного винаходу полягає в розчиненні композиції у ного винаходу мають вміст MAS менше 1%, краще водному середовищі, наприклад, у воді, і потім, менше 0,1%, найкраще менше 0,05% (мас/мас). якщо бажано, додаванні інших складових компоПереважно, коли композиції відповідно до данентів, які можуть сприятливо впливати на дозріного винаходу мають вміст добавки більше, ніж вання ооцитів. Інший спосіб застосування компо99%, найкраще більше ніж 99,9%. зиції даного винаходу полягає в її розчиненні у Кращими композиціями відповідно до даного середовищі, що звичайно використовують для винаходу є такі, що можуть бути оброблені водним дозрівання in vitro. середовищем, що не містить органічного розчинДаний винахід ілюструється наступними приника або містить його тільки у низьких концентракладами які, однак, не повинні розглядатися як ціях, що приводить до розчину, який містить MAS. такі, що обмежують обсяг захисту винаходу. ВласБажано, коли водне середовище містить менше тивості, розкриті в описі винаходу та послідуючих ніж 1%, краще менше ніж 0,5%, найкраще менше прикладах, в будь-якій їх комбінації, можуть бути ніж 0,1% органічного розчинника (мас/мас). використані для здійснення даного винаходу у Вчинені раніше спроби приготувати композирізноманітних видах. ції, які б задовольняли даним вимогам, виявилися Приклад 1 невдалими. Спосіб визначення чи сполука являє собою У даному тексті термін "речовини, що активуMAS, чи ні. ють мейоз" (MAS), означає сполуки, які опосередОоцити були отримані від нестатевозрілих ковано викликають мейоз ооцитів. Точніше кажучи, мишей жіночої статі (C57BL/6J´DBA/2JF1, MAS являють собою сполуки, при досліджені яких Bomholtgaard, Данія) вагою 13-16 грам, що утриу наведеному нижче Прикладі 1, розпад зародкомувались при контрольованій температурі (20вого пухирця (в даному тексті GVB), виражений у 22°С), освітленні (освітлення з 06.00 до 18.00) і відсотках, був значно вищий, ніж розпад у контровідносній вологості (50-70%). Мишам робили внутлі. Кращими MAS є такі сполуки, які сприяють рішньочеревну ін'єкцію 0,2мл гонадотропінів GVB, що становить щонайменше 50%, найкраще (Gonal-F, Serono), що містить 20М.О. міжнародних щонайменше 80%. Прикладами кращих MAS є 4,4одиниць (IU) фолікулостимулюючого гормону диметил-5a-холеста-8,14,24-триєн-3b-ол (далі по (FSH), і через 48 годин тварин вбивали шляхом цервікальної дислокації. Яєчники відтинали і ооцитексту FF-MAS); гемісукцинат 4,4-диметил-5aти ізолювали у Нх-середовище (див. нижче) під холест-8,14,24-триєн-3b-олу; 5a-холест-8,14-дієнстереомікроскопом шляхом мануального відриву 3b-ол; гемісукцинат 5a-холест-8,14-дієн-3b-олу; фолікул, з використанням пари голок розміру 27. (20S)-холест-5-ен-3b,20-діол; N-(метіонін)амід 3bСферичні ооцити, що мали інтактний зародковий гідрокси-4,4-диметил-5a-хола-8,14-дієн-24-ової пухирець (далі по тексту GV), були розділені на кислоти та холест-5-ен-16b-ол. Інші приклади MAS ооцити, оточені яйценосним пухирцем (далі по наведені [у WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, тексту СЕО), та оголені ооцити (далі по тексту NO) 98/28323, 98/54965 і 98/55498], більш точно у п.1 і розміщені у a-мінімальному основному середоФормул винаходу. вищі a-МЕМ (a-minimum essential medium) без риОдин зі способів приготування композицій відбонуклеозидів, (Gibco BRL, Cat. No.22561) з додаповідно до даного винаходу полягає у тому, що ванням 3мг/мл сироваткового альбуміну великої змішують розчин MAS у органічному розчиннику, рогатої худоби (BSA, Sigma Cat No.A-7030), 5мг/мл такому як, наприклад, етанол, з водним розчином сироваткового альбуміну людини (HSA, State добавки і після цього залишають суміш до тих пір, Serum Institute, Данія), 0.23мМ пірувату (Sigma, поки розчинник не випариться. Випаровування Cat. No.S-8636), 2мМ глютаміну (Flow Cat. No.16може бути прискорене застосуванням засобу по801), 100IU/мл пеніциліну і 100мкг/мл стрептоміцистійного обдування над продуктом, за допомогою ну (Flow, Cat No.16-700). До цього середовища вакуум у або будь-яких інших прийнятних способів додали 3мМ гіпоксантину (Sigma Cat. No.H-9377), і видалення розчинника. Комерційний продукт може позначили як Нх-середовище. являти собою систему доставки, що має одне або Ооцити промивалися тричі у Нх-середовищі та більше заглиблення або порожнину. Далі по текс 5 78183 6 однорідні за розмірами ооцити розділяли на групи фільтр з розміром пор 0,22мкм, визначали вміст СЕО і NO. CEO і NO культивували в 4-лункових FF-MAS за допомогою HPLC і розраховували розпланшетах (Nunclon, Denmark), у яких кожна лунка чинність. Переносили 350мкл розчину у 4містила 0,4мл Нх-середовища і тестову сполуку з лунковий планшет і залишали випарюватись до концентрацією 10мкМ. Одну контрольну лунку сухого залишку при кімнатній температурі. Дода(тобто, 35-45 ооцитів культивували в ідентичному вали 500мкл a-MEM середовища (Gibcobal). Якщо середовищі без додавання тестової сполуки) завпротягом півгодини утворювався чистий розчин, то жди культивували одночасно з 3 дослідними лункомпозицію тестували на ооцитах, отриманих від ками (35-45 ооцитів на лунку з додаванням тестонестатевозрілих мишей жіночої статі. Отриманий в вої сполуки). Ооцити культивували у зволоженій результаті досліджень рівень GVB становив, приатмосфері повітря з 5% вмістом СО2, протягом 24 наймні 50%, краще 80%, див. Приклад 1. годин при температурі 37°С. В кінці періоду кульПриклад 3 тивування кількість ооцитів з GV, GVB і полярними Композиція, що містить сироватковий альбумін тільцями (далі по тексту РВ), відповідно, були підлюдини (HSA). раховані з використанням стереомікроскопу (Wildt, У даному прикладі були одержані 3 продукти. Leica MZ 12). Відсоток GVB, визначений як відсоЯк видно з таблиці, наведеній нижче, основний ток ооцитів, що піддалися GVB, до загальної кільрозчин FF-MAS, використовували для продукту 1, кості ооцитів у лунці, був підрахований таким чи2, і 3, що містив 50, 500 і 3330мкг/мл відповідно. ном: % GVB= ((кількість GVB+ кількість РВ)/ Для кожного з продуктів основний розчин HSA місзагальну кількість ооцитів) X 100. тив 20% HSA. Кількість зазначених основних розПриклад 2 чинів, що використовувалися, вказана у таблиці. Спосіб визначення того, чи можна застосовуНаприклад, для продукту 1 основний розчин FFвати сполуку як добавку в композиціях відповідно MAS у кількості 400мкл змішували з 1000мкл оснодо даного винаходу, чи ні. вного розчину HSA. Після змішування зазначених Добавки для композицій, що містять FF-MAS, основних розчинів розчини були прозорими, і у них характеризуються тим, що: не спостерігалось випадання осаду. Після переміпокращують розчинності FF-MAS у суміші еташування кількість розчину, вказану у таблиці, пенол/вода (1:2,5об./об.) реносили у 4-лункові планшети (Nuclon, Denmark). сприяють тому, що розчин FF-MAS залишаНаприклад, для продукту 1 суміш у кількості ється прозорим після відтворення композиції у 350мкл переносили у планшет. Нарешті, розчини середовищі a-МЕМ. випаровували до сухого залишку при кімнатній Одержаний у результаті досліджень рівень температурі. Після випаровування деякі продукти GVB становив, принаймні 50%, переважно 80%, утворювали опалесцюючу прозору плівку в планпри дослідженні сполук на ооцитах, отриманих від шетах, інші були невидимі для людського ока. нестатевозрілих мишей жіночої статі. Найвища концентрація FF-MAS, розчиненого у Одержували насичений розчин FF-MAS в етаданому прикладі становила 0,95мг/мл. нолі. Змішували з водним розчином добавки у Перед використанням додавали 500мкл сереспіввідношенні 1:2,5. Шляхом візуального огляду довища a-MEM (Gibcobal), і отримували прозорий контролювали, щоб розчин містив надлишок FFрозчин FF-MAS і HSA протягом півгодини при кімMAS. Перемішувати розчин протягом 24 годин при натній температурі. кімнатній температурі. Фільтрувати розчин через Розчин FF-MAS у е танолі, 50мкг/мл Розчин FF-MAS у е танолі, 500мкг/мл Розчин FF-MAS у е танолі, 3,33мг/мл Розчин HSA у воді, 20% Кількість, перенесена у планшет Співвідношення між FF-MAS і HSA Вигляд розчину перед випаровуванням Приклад 4 Композиції, що містить сироватковий альбумін людини (HSA). Аналогічно описаному у попередньому прикладі способу розчини FF-MAS у суміші вода/етанол, що містять HSA, були одержані у вказаних нижче концентраціях шляхом змішування при кімнатній температурі. Після виготовлення розчини були прозорими і без залишку. Розчини перенесли у 4-лункові планшети (Nuclon, Denmark). Нарешті, розчини випарювали до сухого 4-лунковий план- 4-лунковий план- 4-лунковий планшет No.1 шет No.2 шет No.3 400мкл 400мкл 450мкл 1000мкл 1000мкл 1125мкл 350мкл 350мкл 525мкл 1:10000 1:1000 1:150 Прозорі безбарвні розчині і без осаду залишку при кімнатній температурі. Перед використанням додавали 500мкл середовища a-MEM (Gibcobal), і протягом півгодини при кімнатній температурі отримували прозорий розчин FF-MAS і HSA. Композиції досліджували на ооцитах, отриманих від нестатевозрілих мишей жіночої статі. Рівні GVB (%) для відповідних композицій наведені у таблиці нижче. 7 78183 4-лунковий план- 4-лунковий план- 4-лунковий планшет No.1 шет No.2 шет No.3 100мкл 100мкл 100мкл 250мкл 250мкл 250мкл 1:10000 1:2000 1:200 0,5мкг 2,5мкг 25мкг 72 93 91 Розчин FF-MAS у е танолі, 5,22мкг/мл Розчин FF-MAS у е танолі, 26,1мкг/мл Розчин FF-MAS у е танолі, 261мг/мл Розчин HSA у воді, 20% Співвідношення між FF-MAS і HSA Теоретична кількість FF-MAS на лунку % GVB Приклад 5 Композиції, що містить сироватковий альбумін людини (HSA). Аналогічно описаному у попередньому прикладі способу розчини FF-MAS у суміші вода/етанол, що містять HSA, були одержані у вказаних нижче концентраціях шляхом змішування при кімнатній температурі. Після виготовлення розчини були прозорими і без залишку. Розчини перенесли у 4-лункові планшети (Nuclon, Denmark). Нарешті, розчини випарювали до сухого Розчин FF-MAS у е танолі, 26,1мкг/мл Розчин FF-MAS у е танолі 7,83мкг/мл Розчин FF-MAS у е танолі, 5,22мг/мл Розчин FF-MAS у е танолі, 2,5мкг/мл Розчин FF-MAS у е танолі, 0,5мкг/мл Розчин HS А у воді, 20% Співвідношення FF-MAS і HSA Теоретична кількість FF-MAS на лунку Відсотковий склад GVB Комп’ютерна в ерстка Т.Чепелева 8 залишку при кімнатній температурі. Перед використанням додавали 500мкл середовища a-MEM (Gibcobal), і протягом півгодини при кімнатній температурі отримували прозорий розчин FF-MAS і HSA. Композиції досліджували на ооцитах, отриманих від нестатевозрілих мишей жіночої статі. Рівні GVB (%) для відповідних композицій наведені у таблиці нижче. 44444лунковий лунковий лунковий лунковий лунковий планшет планшет планшет планшет планшет No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 100мкл 100мкл 100мкл 100мкл 100мкл 250мкл 250мкл 250мкл 250мкл 250мкл 1:100000 1:20000 1:10000 1:6667 1:2000 0,05мкг 0,25мкг 0,5мкг 0,75мкг 2,5мкг 13 52 78 82 90 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601