Спосіб визначення хлорорганічних пестицидів і синтетичних піретроїдів у біологічних об’єктах

Винахід, що передбачається відноситься до сільського господарства, а саме до визначення хлорорганічних пестицидів і синтетичних піретроїдів у біологічних об'єктах, застосовується в ветеринарній медицині. Визначення хлорорганічних пестицидів і синтетичних піретроїдів можливо використовувати при санітарногігієнічній оцінці продуктов тваринництва та при проведенні токсикологічних досліджень біологічних об'єктів. До хлорорганічних пестицидів відносяться: J-ГХЦГ (гексахлорциклогексан, гексахлоран). Емпірична формула – С6Н6СL6; ДДТ (його метаболіти - ДДД, ДДЄ). Емпірична формула – С14Н9CL5; Дилор. Емпірична формула – С10Н7CL7; Кельтан (дікофол, хлоретанол, акарин). Емпірична формула – С14H9OCL5; До синтетичних піретроїдів відносяться: Амбуш (перметрин, корсар і інш.). Емпірична формула – С21Н20СL2О3; Децис (дельтаметрин, декаметрин, суперметрин). Емпірична формула - С22Н19Вч2NO3; Карате (цігалотрин). Емпірична формула – С23Н19СL3О3; Цимбуш (арріво, шерпа, ріпкорд). Емпірична формула - С22Н19NСL2O3; Фастак (альциперметрин). Емпірична формула - С22Н19NО3СL2; Існують методичні вказівки „Визначення мікрокількостей пестицидів в продуктах харчування, кормах та навколишньому середовищі. Укрдержхімкомісія, зб. №21, 41-а. Київ-1995, с.91-101." Ці вказівки використовують для визначення пестицидів. Спосіб визначення, що є в цій методиці може бути прототипом тільки для визначення пестицидів. Є методика визначення синтетичних піретроїдів методами газорідинної та тонкошарової хроматографії (Метод, указания по определению синтетических пиретроидов методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии в растениях, почве, воде водоемов, Москва, 22 октября, 1981г. №2473-81). Це рішення може бути прототипом при використанні його тільки для визначення піретроїдів. Способи визначення пестицидів і піретроїдів містять визначення діючих компонентів-речовин, очищення екстрактів, перерозподіл компонентів, доочищення екстрактів колонковою хроматографією. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб визначення хлорорганічних пестицидів і синтетичних піретроїдів у біологічних об'єктах, що містить вилучення діючих компонентів, очищення екстрактів осаджуванням і ультрафільтрацією, перерозподіл пестицидів і піретроїдів у неполярний органічний розчинник, доочищення екстрактів колонковою хроматографією шляхом одночасного доочищення екстрактів хлорорганічних пестицидів і синтетичних піретроїдів та використання одного екстрагенту - ацетону або етилового спирту, щоб забезпечити визначення хлорорганічних пестицидів та синтетичних піретроїдів у біологічних об'єктах. Спосіб виконується таким чином: вилучають хлорорганічні пестициди і синтетичні піретроїди із біосубстратів і кормів органічними розчинниками, очищують екстракти осаджуванням та ультрафільтрацією, і потім перерозподіляють їх у неполярний органічний розчинник, доочищаючи екстракти колонковою хроматографією та ідентифікують препарати способом газорідинною або тонкошаровою хроматографією. Приклад 1 Таблиця 1 Метрологічна характеристика способу визначення хлорорганічних пестицидів газовою хроматографією (на прикладі аналізу проб м'яса). Статистичні показники Межа визначення, мг/кг К-сть паралельних проб Розмах варіювання, % М±т, % Стандартне відхилення, % Медіана, % ГХЦГ 0,005 5 64-75 70,2±1,88 4,21 70,0 ДДТ, ДДД, ДДБ 0,02 5 62-80 72,0±1,90 4,24 74,0 Ділор 0,01 5 71-83 74,4±3,20 7,16 77,0 Кельтан 0,01 5 63-76 78,4±2,27 5,08 79,0 Приклад 2 Таблиця 2 Метрологічна характеристика способу визначення синтетичних піретроїдів газовою хроматографією (на прикладі аналізу проб м'яса). Статистичні показники Межа визначення, мг/кг К-сть паралельних проб Розмах варіювання, % М±т, % Стандартне відхилення, % Медіана, % Приклад 3 Амбуш 0,1 5 63-76 69,8±2,71 6,06 71,0 Децис 0,1 5 65-79 72,8±3,02 6,76 76,0 Цимбуш 0,1 5 60-81 71,6±4,20 9,40 73,0 Карате 0,1 5 59-70 67,2±2,52 5,63 68,0 Фастак 0,1 5 55-72 66,8±3,07 6,87 69,0 Таблиця 3 Межі визначення хлорорганічних пестицидів і піретроїдів при використанні різних хроматографічних способів. Пестицид J-ГХЦГ ДДТ (ДДД, ДДЕ) Дилор Кельтан Амбуш Децис Цимбуш Карате Фастак газорідинна хроматографія мкг/мл проби мг/кг продукта 0,005 0,005 0,02 0,02 0,02 0,01 0,02 0,01 0,2 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1 тонкошарова х мкг на пластинці 1 1 1 1 2 2 2 2 2 зоматографія мг/кг продукта 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Приклад 4. Стандартні розчини пестицидів готували за прописами, які прикладаються до стандартних зразків. Готували основний розчин препарату з концентрацією 1мг в 1мл гексану. Із основного розчину готували робочі стандартні розчини для тонкошарової хроматографії з концентрацією 100мкг в 1мл, а для газорідинної хроматографії - 1мкг в 1мл і 0,1мкг в 1мл. Зберігали стандартні розчини в побутовому холодильнику в щільно закупорених флаконах, які виключали випаровування органічних компонентів. Приклад 5. На дослідження брали середню пробу тваринного жиру, масла вершкового, масла рослинного, маргарину - 2г, жовтку яйця - 5г. Наважку поміщали в колбу на 100мл і заливали 50мл етилового спирту. Суміш в колбі підігрівали на водяній бані при 60-70°С, постійно перемішуючи протягом 10 хвилин. Після цього колбу охолоджували у випарювальній камері холодильника. Екстракт зливали у чисту колбу і додавали туди 2,5 мл дистильованої води, 0,2мл розчину оцтовокислого свинцю і суміш охолоджували в холодильнику при температурі (-5°)-(-10°С) протягом 1-2 годин. Охолоджений екстракт центрифугували в охолодженому центрифужному стакані при 2-2,5 тисячах обертів на хвилину протягом 3-5 хвилин. Надосадову рідину декантували в чистий центрифужний стакан, додавали туди 7,5мл дистильованої води і 0,1мл розчину оцтовокислого свинцю. Суміш охолоджували в холодильнику при тих же умовах протягом 1 години і потім центрифугували 3-5 хвилин. Надосадову рідину зливали в ділильну лійку, додавали 10мл дистильованої води і екстрагували препарати двічі гексаном (15 і 10 мл). Гексан випаровували до сухого або маслянистого осаду. Залишок змивали 7мл етилового спирту в центрифужну пробірку, додавали 3мл дистильованої води, 0,1мл оцтовокислого свинцю і охолоджували в холодильнику протягом 1 години при температурі (-5°С). Охолоджену суміш центрифугували 3 хвилини, зливали в ділильну лійку і екстрагували препарати двічі гексаном. В гексан переходили усі хлорорганічні з'єднання і синтетичні піретроїди. Гексан концентрували до об'єму 1-2мл і ідентифікували препарати способом газорідинної або тонкошарової хроматографії зразу або після додаткового очищення способом колонкової хроматографії. Приклад 6. Для дослідження відбирали 3-5г подрібненого корму і переносили в хроматографічну колонку діаметром 1,2-1,6см. Комбікорм засипали зверху і ущільнювали шар, постукуючи по стінках дерев'яною паличкою. Після цього в колонку наливали етиловий спирт так, щоб він змочив всю масу корму. Для зливу спирту підставляли мірну пробірку. Коли спирт змочив весь комбікорм, доливання спирту припиняли і видержували колонку в цьому стані 15-30 хвилин. Збирали елюат. Зібраний елюат переносили в центрифужний стакан, додавали туди дистильованої води і розчину оцтовокислого свинцю. Суміш перемішували, охолоджували в випарювальній камері холодильника і центрифугували. Надосадову рідину переносили в чистий центрифужний стакан, додавали дистильованої води, 0,1мл 20% розчину оцтовокислого свинцю і охолоджували в холодильнику протягом 1 години. Після цього суміш центрифугували, надосадову рідину зливали в ділильну лійку (або чистий хімічний стакан). Екстракт в ділильній лійці обробляли гексаном двічі, використовуючи кожен раз по 5-6мл органічного розчинника. Об'єднаний гексановий екстракт промивали 2мл дистильованої води. Нижній водяний шар відкидали і гексан використовували для визначення хлорорганічних пестицидів і деяких других токсикантів способом колонкової рідинної хроматографії. Приклад 7. Для дослідження відбирали середню пробу: комбікорму, зерна подрібненого, вмісту шлунка, м'яса нежирного, м'яса жирного, печінки, нирок, силосу, зелених рослин, сіна, соломи і ґрунту. Відібрану наважку поміщали в колбу і заливали етиловим спиртом. Суміш перемішували, злегка підігріваючи вміст колби на водяній бані при температурі 70-75°С, і залишали для екстракції, при періодичному помішуванні, не менше чим на 2-4 години. Потім зливали 40мл екстракту в чисту колбочку, добавляли туди 4мл дистильованої води і 0,4мл розчину оцтовокислого свинцю. Суміш охолоджували у випарювальній камері холодильника, переносили в охолоджений центрифужний стакан і центрифугували 3-5 хвилин. Надосадову рідину переносили в центрифужний стакан, додавали туди ще 10мл води і 0,2мл розчину оцтовокислого свинцю. Потім суміш знову охолоджували у випарювальній камері холодильника протягом 1 години. Охолоджений екстракт центрифугували і зразу зливали надосадову рідину в ділильну лійку або чистий хімічний стакан. Водно-спиртовий екстракт двічі екстрагували гексаном (15 і 10мл). Гексан упарювали до отримання сухого або маслянистого осадку і використовували для визначення хлорорганічних з'єднань після очищення. Залишок після випарювання гексану розчиняли в 7 мл спирту, добавляли дистильованої води, 0,1мл розчину оцтовокислого свинцю і охолоджували суміш при температурі (-5°С) 30 хвилин. Потім суміш центрифугували. Надосадову рідину зливали і фільтрували через шприц насадку „Міліпор" (розмір пор 0,1-0,2мкм). Пестициди реекстрагували із фільтрату двічі гексаном. Гексановий екстракт концентрували до об'єму 1-2мл і використовували для ідентифікації пестицидів зразу або після очищення на колонці. Приклад 8. Відібрану наважку поміщали в колбу на 100мл і заливали 80мл ацетону. Суміш перемішували, злегка нагріваючи на водяній бані. Потім суміш залишали для екстракції при періодичному перемішуванні на 2-4 години. Після цього зливали 40мл екстракту, який розміщували в чисту колбу і додавали туди дистильованої води і 0,4мл розчину оцтовокислого свинцю. Суміш охолоджували у випарювальній камері холодильника протягом, переносили в охолоджений центрифужний стакан і центрифугували 3-5 хвилин. Надосадову рідину зливали в чистий хімічний стакан і упарювали на водяній бані при температурі 75-80°С до утворення маслянистого осадку. Осадок розчиняли в 7мл спирту, зливали його в центрифужну пробірку, додавали туди 3мл дистильованої води і розчину оцтовокислого свинцю. Суміш охолоджували у випарювальній камері холодильника протягом 1 години, центрифугували, надосадкову рідину зливали і екстрагували в ділильній лійці гексаном двічі, використовуючи кожен раз по 4мл екстрагента. Об'єднаний гексан промивали 2 мл дистильованої води, просушували 200мг натрію сірчанокислого безводного і концентрували до об'єму 1-2мл. Сконцентрований гексановий екстракт використовували зразу для визначення хлорорганічних з'єднань або після очищення способом колонкової хроматографії. Приклад 9. 50мл молока переносили в колбу з притертою пробкою, додавали туди 50мл спирту і 15мл гексану. Суміш перемішували і центрифугували. Надосадову рідину зливали в ділильну лійку. Нижній водно-спиртовий шар переносили в чисту ділильну лійку, приливали туди 15мл гексану і перемішували протягом 3 хвилин. Якщо необхідно, суміш центрифугували. Потім відділяли гексановий шар. Об'єднаний гексан упарювали до отримання маслянистого залишку і використовували для визначення хлорорганічних з'єднань і синтетичних піретроїдів. Приклад 10. Сконцентровані до 1-2мл гексанові екстракти пропускали через хроматографічну колонку з оксидом алюмінію і силікагелем АСК. Перед використанням колонку промивали 5 мл гексану. Потім в колонку вносили підготовлені і сконцентровані до об'єму 1-2мл гексанові екстракти. Хлорорганічні пестициди вимивали із колонки 8мл суміші гексана з бензолом в співвідношенні 7 до 3. Синтетичні піретроїди вимивали із колонки 8,0мл бензолу. Екстракт який пройшов через колонку концентрували до об'єму 0,5-2,0мл і використовували для ідентифікації пестицидів способом газорідинної або тонкошарової хроматографії. Приклад 11. Для ідентифікації хлорорганічних пестицидів і синтетичних піретроїдів використовували хроматограф з детектором по захвату електронів з наступними режимами роботи: - для визначення хлорорганічних пестицидів: газ-носій - азот, 30мл/хв., температура: випарювача - 230°С, термостата колонок - 190-200°С, детектора -250°С. Колонка скляна діаметром 4мм, довжиною їм заповнена хроматоном N-AW-DMCS з 5% SE-30. - для визначення піретроїдів: газ-носій - азот (30мл/хв.).Температура випарювача - 250°С, термостата колонок - 250°С, термостата детектора -260°С. Колонка скляна діаметром 4мм, довжиною їм або менше заповнена хроматоном N-AW-DMCS з 5% SE-30. Газ-носій - азот особої чистоти (або аргон вищої категорії очищення). Швидкість подачі газу на колонку - 30мл за хвилину, на продування детектора - 70-100мл за хвилину. Робоча шкала електрометра від 5 до 20х10-12 А. При роботі хроматографа на аргоні використовували шкалу з більш вищою чутливістю (10 або 5х10-12 А). Ідентифікацію пестицидів проводили за часом утримання, кількісну оцінку - за величиною піка (висота піка або його площа). Калібровку приладу проводили за допомогою стандартних розчинів пестицидів: 0,01; 0,1 і 1мкг в 1мл, щоденно перед початком і кінцем роботи. В випарювач хроматографа вводили 1-5мкл стандартного або аналізуємого розчину. Якісну ідентифікацію пестицидів здійснювали за часом утримання. Кількісне визначення пестицидів в пробі проводили методом порівнювання висоти або площі піка стандартного і дослідного розчину окремо для дослідної і стандартної проб. Розрахунки проводили за формулою: Упр(мл) ´ Ст(нг ) ´ Нпр ´ 100 C= Ур - н(нкл ) ´ Нст ´ М( г ) ´ К Де: Х - кількість пестициду в пробі в мг на кг; Упр - об'єм екстракту в мл; Ст(нг) - кількість пестициду в нг введеного у випарювач хроматографа зі стандартним розчином; Нпр - висота піка аналізуємої проби в мл; Ур-н - кількість екстракту введеного в хроматограф в мкл; Нст - висота піка стандарту в см; Мпр - маса проби взятої для екстракції (в г або мл); 100 - коефіцієнт для внесення поправки на втрати пестициду при К екстракції і підготуванні проби для дослідження, де К - визначаємість пестициду в %. Приклад 12. Для ідентифікації пестицидів використовували хроматографічні платівки з закріпленим шаром силікагелю. Перед використанням платівку поміщали в хроматографічну камеру, заповнену сумішшю ацетон : вода в різних кількостях (50x50). Як тільки фронт розчинника піднімався до верхнього краю платівки, її виймали із камери і просушували при температурі 40-50°С протягом 1-2 годин. На приготовленій таким чином платівці проводили розмітку за загальними правилами хроматографічних досліджень: лінія старту на 1,2-1,5см від нижнього краю платівки, відстань між точками нанесення - 1,5см. Сконцентрований до об'єму 0,2-0,5мл очищений екстракт наносили в точку старту за допомогою мікро шприца. При цьому відмічали кількість вихідного і кількість нанесенного екстракту. Параллельно з дослідними зразками наносили певні кількості (від 1 до 20мкг) пестицидів „свідків". Хроматографування проводили в наступних системах рухливого розчинника: при визначенні хлорорганічних з'єднань - 2% ацетон в гексані; при визначенні піретроїдів-гексан : діетиловий ефір в співвідношенні 3 : 1 або гексан : бензол в співвідношенні 1:1. Приклад 13. Таблиця 4 Величини констант Rf аналізуємих пестицидів на платівці "Silufol" при різних умовах розділення. Пестицид 1 ДДТ ДДЕ ГХЦГ Ділор Кельтан Амбуш Цимбуш Децис Карате 2% ацетон в гексані 2 0,60 0,90 0,20 0,30 0,60 0,15 0,05 0 0 Гексан : діетиловий ефір3:1 3 0,80 0,90 0,80 0,60 0,80 0,90 0,75 0,60 0,60 Гексан: бензол -1:1 4 0,95 0,95 0,60 0,40 0,30 0,30 Приклад 14. Кількісне визначення пестицидів в пробі проводили порівнюванням площі і інтенсивності забарвлення або світіння плям проб і препаратів „свідків" за формулою: A ´ 100 C= , M´K Де: А - кількість пестициду в пробі в мг на кг; М - маса проби взятої для екстракції (в г або мл); 100 - коефіцієнт для внесення поправки на втрати пестициду при К екстракції і підготуванні проби для дослідження, де К - визначаємість пестициду в % . Спосіб визначення є ефективним і дає змогу одночасно визначати хлорорганічні і піретроїдні пестициди при проведенні контролю за залишками цих препаратів в біологічних об'єктах.