Спосіб визначення металотіонеїну в біологічних об’єктах

Спосіб визначення металотюнешу (МТ) в біологічних об'єісгах шляхом виявлення кадмію, при осадженні його реактивом, який відрізняється тим, що визначення МТ проводять атомно-абсорбційним методом, а як реактив використовують неорганічну сіль, наприклад карбонат кальцію Винахід відноситься до області медицини, а саме до клініко-лабораторної діагностики, і може бути застосований як скрінінг металотюнешу [МТ] в крові, сечі, тканинах плацент, тощо Відомий спосіб визначення МТ по Dieter Н Н (1987), в основі якого лежить виявлення кадмію, осадженого гемоглобіном Кадмій чи другий важкий метал витісняє з металотюнешу атоми цинку чи МІДІ та стає на їх місце По КІЛЬКОСТІ кадмію, який став у МТ, визначають вміст металотюнешу Недоліком такого способу є те, що реактив гемоглобін досить дорогий, що знижує доступність цього метода Крім того, автором застосовано радіоізотопний спосіб, який є менш точнішим В основу винаходу поставлено задачу вдосконалення способу діагностики МТ в біологічних рідинах та тканинах шляхом застосування атомноабсорбційного метода, що дозволяє підвищити точність даної маніпуляції та знизити вартість дослідження Поставлена задача вирішується тим, що визначення МТ проводять атомно-абсорбційним способом, а як реактив застосовують неорганічну сіль (карбонат кальцію, тощо) замість гемоглобіну Спосіб виконується таким чином Принцип методу оснований на здатності кадмію витісняти з металотюнешів цинк і мідь і зв'язуватись з металотюнешами в стехіометричних кількостях (7 атомів на 1моль білку) По вмісту кадмію, який зв'язувався з металотюнешами, розраховували їх металотюнешів Хід визначення Готування проб При визначенні металотюнешів в тканинах готували гомогенат з розрахунку ЮОмг вологої тканини на 1мл бідистильованої води Для аналізу брали 1мл гомогенату і розбавляли 2мл бідистильованої води При аналізі плазми крові 1мл плазми розбавляли 2мл бідистильованої води При аналізі гепаринизованої крові або еритроцитарної маси 1мл зразку розбавляли 2мл бідистильованої води для того, щоб проходив гемоліз Осадження високомолекулярних білків Отриману пробу переносили в центрифужні пробірки і додавали 0,3мл 30% ТХО кислоти для повного осадження високомолекулярних білків Центрифугували 15 хвилин при ЗОООоб/хвил Зливали супернатант в чисті центрифужні пробірки Він містить низькомолекулярні білки, частина з яких здатна зв'язувати кадмій і відноситься нами до металотюнешів Заміщення металів в металотюнешах кадмієм В отриманий центрифугат вносили 0,2мл розчину Cd + 2 з концентрацією 100мкг/мл Надлишок кадмію потрібен для того, щоб ІОНІВ Cd + 2 явно хватило для повного заміщення цинку і МІДІ В метал отюнешах Пробу витримували 10 хвилин для повного проходження реакції Видалення надлишкового кадмію 3 отриманої системи видаляють надлишок Cd + 2 Для цього використовують осадження кадмію гемоглобіном, який зв'язує вільний кадмій, що знаходиться в розчині (т з гемоглобшовий метод) (5) Модифікували методику, замінивши осадження кадмію гемоглобіном співосадженням з карбонатом кальцію Відомо, що при співосаджуванні вдається практично повністю осадити СЛІДОВІ КІЛЬКОСТІ ІОНІВ металів (9) В пробу при перемішуванні вносили 0,5мл 1М розчину СаСЬ і 1,0мл 1М розчину ЫагСОз Пробу со ^о (О 60439 центрифугували 20 хвилин при 8000об/хвмл Розкладання органічних речовин Надосадкова рідина містить зв'язані з кадмієм металотюнеіни і різні низькомолекулярні органічні сполуки Надосадкову рідину зливали в тефлоновий стаканчик і поміщали на 4 години в автоклав (260°С, середовище - концентрована НІЧОз) для розкладання органічних речовин Визначення вмісту кадмію Пробу після автоклавування КІЛЬКІСНО переносили в мірну колбу на 25мл Доводили об'єм розчину до мітки бідистильованою водою і визначали +2 в ньому концентрацію Cd Концентрацію металотюнешів в вихідному зразку розраховували за формулою (1) для гомогенату тканини і (2) для зразків крові, плазми, еритроцитарної маси 250-c c r f + = 318,9-C Cd 2 + , (нмоль/г) (2 1) 7-112 25 1000 с Ccl2+ 2+ , (нмоль/г) (2 2) 7 112 де, 250 та 25 - розбавлення проби для гомогенату тканини і (2 2) для зразків крові, плазми, еритроцитарної маси (2 1), 112г/моль - молярна маса Cd, 1000 - коефіцієнт приведення мкмоль/л до нмоль/л, 7 стехіометричне співвідношення Cd /металотюнеш, Комп'ютерна верстка Т Чепелєва Сг.+2 - концентрація Cd в зразку, який аналі зують, визначена атомно-адсорбційним методом, мкг/л, Таким чином, на стадії видалення надлишку кадмію з реакційного середовища осадження його гемоглобіном було замінено співосадженням з карбонатом кальцію Операція дає можливість практично повністю осаднити СЛІДОВІ КІЛЬКОСТІ ІОНІВ металів Для цього в пробу при постійному перемішуванні вносили 0,5мл 1М розчину СаСЬ і 1,0мл 1М розчину ЫагСОз, після чого пробу центрифугували 20хвил при 8000об/хвип в надосадковій рідині визначали вміст МТ Отримані результати виявились більш відтворюваними порівняно з гемоглобшовим методом, із прототипом (т=±7 і 11% ВІДПОВІДНО) Таким чином, при модифікації методу вдалось без втрати чутливості і ускладнення процедури досліду замінити досить дорогий реактив (гемоглобін) більш дешевими і доступними неорганічними солями (карбонатом натрію і хлоридом кальцію), а також складний для виконання радіоізотопний метод більш простим - атомно-адсорбційним Список літератури 1 Dieter Н Н et al "Metalotionem - determination in biological materials mtralaboratory comparison of 5 methods" - Biochimical genetics of metallotionem Vol 52,1987 Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119