Елективне напівсинтетичне живильне середовище члв для виділення і культивування мікобактерій

Елективне напівсинтетичне живильне середовище для виділення і культивування мікобактерій, що містить гліцерин, яєчну масу, малахітовий зелений і дистильовану воду, яке відрізняється тим, що з метою підвищення ростових властивостей і зниження собівартості середовища до його складу як основне джерело азотного, мінерального та вітамінного живлення мікроорганізму введено екстракт ростків вики при такому співвідношенні інгредієнтів, мас. %: екстракт ростків вики 40,0-50,0 гліцерин 1,2 яєчна маса 45,0 2%-й водний розчин малахітового зеленого 2,3 вода дистильована 11,5-1,5 рН 7,2-7,4. Корисна модель відноситься до ветеринарної і медичної мікробіології і стосується одержання живильних середовищ для виділення й культивування мікобактерій туберкульозу і може бути використана у роботі діагностичних і науково-дослідних лабораторій з метою виділення мікобактерій з різних джерел та накопичення їх бактеріальної маси для вивчення біологічних властивостей. Відоме середовище для виділення культур мікобактерій групи авторів ІЕКВМ УААН, яке містить амоній азотнокислий, калій фосфорнокислий однозамінний, магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, цинк сірчанокислий, гліцерин, яєчну масу і 2%-й водний розчин малахітового зеленого [1]. Найбільш близьким за технічним рішенням, вибраним як прототип, є середовище Левенштейна-Йєнсена, яке містить калію фосфат однозамінний, магнію сульфат, натрію цитрат, Л-аспарагін, гліцерин, яєчну масу і малахітовий зелений [2]. Недоліками цього середовища є: недостатня діагностична ефективність (до 40%); до його складу входить Л-аспарагін, який на сьогодні не виробляється промисловістю України; його висока собівартість. В основу корисної моделі поставлені завдання: провести пошук компоненту, введення якого до складу середовища дозволило б вивести з нього Л-аспарагін, підвищити його ростові властивості і знизити собівартість. Поставлене завдання вирішено шляхом введення до складу середовища замість Л-аспарагіну екстракту ростків вики і зміни інгредієнтів при такому їх співвідношенні, мас. %: екстракт ростків вики 40,0-50,0 гліцерин 1,2 яєчна маса 45,0 2%-й водний розчин малахітового зеленого 2,3 вода дистильована 11,5-1,5 рН 7,2-7,4 Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок, що заявлений склад середовища відрізняється від відомого заміною Ласпарагіну екстрактом ростків вики та виведенням солей калію фосфату, магнію сульфату та натрію цитрату. Такий склад інгредієнтів забезпечує більш високі ростові властивості середовища, здешевлює його в 1,4 рази у порівнянні з середовищем Левенштейна-Йєнсена і не потребує для виготовлення імпортний компонент, Л-аспарагін. Живильне середовище ЧЛВ виготовляють таким чином: І етап. Одержання ростків вики. Боби вики заливають водопровідною водою і витримують протягом 12 годин при кімнатній температурі. Потім боби поміщають у кювети на вологий фільтрувальний папір, який періодично змочу ео сч ю (О < D 6Г 6752 ють водою Пророщування проводять при 18-24°С у термостаті або кімнаті протягом 4-5 діб Ростки ВІДДІЛЯЮТЬ від бобів, висушують при 37°С у термостаті протягом 5 діб далі в електричному млинку їх перетворюють у порошок і зберігають у герметично закритому посуді II етап Одержання екстракту з ростків вики Суху масу ростків вики висипають у колбу, заливають дистильованою водою (з розрахунку 18г на 10ООмл води) і протягом ЗО хвилин витримують на киплячій водяній бані, потім - у гарячій (6080°С) воді Далі проводять екстракцію у холодильнику (+4°С) протягом 24 годин Екстракт ростків вики відділяють фільтруванням рідини через подвійний паперовий фільтр та за допомогою 10%-го розчину NaOH доводять рН до 7,2-7,4 III етап Виготовлення живильного середовища Яєчну масу готують із свіжих курячих яєць, які ретельно миють щіткою з милом, протирають тампоном, змоченим у 70° спирті, розбивають у стерильну колбу, гомогенізують і фільтрують через подвійний шар марлі, додають до неї гліцерин, екстракт ростків вики, 2%-й розчин малахітового зеленого та дистильовану воду, ретельно розмішують і розливають у бактеріологічні пробірки Коагулюють середовище при 90°С протягом 1 години у апарат» для коагуляції та інактивації сироваток АСИС Приклад 1 Живильне середовище готують, як зазначено вище, при такому співвідношенні інгредієнтів, мас % екстракт ростків вики 40,0 яєчна маса 45,0 гліцерин 1,2 2%-й водний розчин малахітового 2,3 зеленого вода дистильована 11,5 рН 7,2-7,4 Приклад 2 Те саме, що в прикладі 1, за такого співвідношення компонентів, мас % екстракт ростків вики 45,0 яєчна маса 45,0 гліцерин 1,2 2%-й водний розчин малахітового зеленого 2,3 вода дистильована 6,5 рН 7,2-7,4 Приклад З Те саме, що в прикладах 1 і 2, за такого співвідношення компонентів, мас % екстракт ростків вики 50,0 яєчна маса 45,0 гліцерин 1,2 2%-й водний розчин малахітового зеленого 2,3 вода дистильована 1,5 рН 7,2-7,4 Елективні властивості середовища визначають шляхом посіву 0,1 мл суспензії мікобактерій туберкульозу в стерильному фізіологічному розчині хлориду натрію в концентрації 105 мікробних клітин бичачого (штам Vallee), людського (штам №192), пташиного (штам №61) видів та епізоотичних штамів (РП-2, Р11), виділених з патматеріалу, а також проб патологічного матеріалу хворих на туберкульоз тварин Пробірки з посівами закривають ватномарлевими пробками, заливають парафіном і культивують в термостаті при 37°С протягом 90 днів Облік росту колоній мікобактерій проводять через кожні 3-7 днів Результати досліджень наведені в таблиці Таблиця Порівняльні дані живильних середовищ за елективністю Приклади 1 Приклад №1 Приклад №2 Приклад №3 Тест-штами мікобактерій 2 М bovis М tuberculosis М avium (61) РП-2 Р11 Патологічний матеріал М bovis (Vallee) М tuberculosis (192) М avium (61) РП-2 Р11 Патологічний матеріал М bovis М tuberculosis М avium (61) РП-2 Р11 Патологічний матеріал Швидкість росту (діб) Первинний Інтенсивний 4 3 12,2±0,6 20,8±0,7 12,0±2,0 20,1+0,5 6,3±1,5 11,5±0,7 6,1 ±0,2 12,1±0,11 3,5±0,45 9,1 ±0,5 18,0±0,2 21,0+0,01 9,3±0,87 21,1+0,11 9,8±0,3 18,88±0,13 9,1 ±0,45 11,89±0,41 3,4±1,1 9,1 ±0,33 3,2±0,4 9,15+0,44 15,5+0,54 21,1+0,015 9,7±0,38 21,12+0,05 9,1 ±0,41 21,0±0,02 6,7±0,31 8,7±0,05 3,5±2,5 9,3±0,25 3,4±0,27 9,1 ±0,35 15,5+0,64 20,98±0,001 6752 Продовження таблиці 1 2 M.bovis M.tuberculosis Контроль (середовище Левенш- M.avium (61) тейна-Йєнсена) РП-2 Р11 Патологічний матеріал 3 12,9±0,8 15,3±0,4 9,8±0,35 9,3±0,1 6,1±1,0 18,95±0,15 4 21,95±1,0 21,87±0,9 12,1±0,01 12,0±0,13 12,3±1,1 20,7±0,01 Примітка: Р