Спосіб виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини

1. Спосіб виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини, що включає одержання суспензії культури пастерел, інактивацію отриманої культури та з'єднання бактерійного антигену з масляним ад'ювантом, який відрізняється тим, що як імуногени використовують вітчизняні штами пастерел: Pasteurella multocida № 3 серовар Д, № 12 серовар А, № 31 серовар В, які інактивують димерометиленіміну (ДЕІ), який вносять у суспензію культури до концентрації 4-5 % при рН 7,2-7,6, а по закінченні інактивації отриманий антиген вносять у стабілізуюче середовище і з'єднують з масляним ад'ювантом. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що інактивацію ведуть протягом 12-16 годин при 37-38°С. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що по закінченні інактивації бактерійний антиген осаджують центрифугуванням. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як стабілізуюче середовище використовують сахарозо-желатинове середовище. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що антиген і масляний ад'ювант з'єднують у співвідношенні 3:7-1:1. Корисна модель відноситься до області ветеринарної мікробіології, епізоотології і біотехнології і може бути використана при розробці і виробництві засобів специфічної профілактики факторного (ендогенного) пастерельозу молодняка с.-г. тварин. Пастерельоз (лат. Pasteurellosis) - це зоонозна інфекційна хвороба тварин і птахів, а також людини, що характеризується септицемічними явищами і геморагічними запальними процесами слизових оболонок дихальних шляхів і кишечника, пневмонією, плевропневмонією, а також набряками. Інфекційний процес протікає по класичному або факторному типу. В першому випадку інфекційний процес відбувається на потенційних хазяєвах у вигляді геморагічної септицеміїї; у другому на облігатних хазяєвах по типу факторної хвороби і має вигляд ензоотії інфекційної пневмонії пастерельозної етіології. Збудником захворювання є нерухома дрібна овальна грамнегативна бактерія 0,25-0,5мкм шириною і 0,5-2мкм довжиною. Пастерели, які викликають захворювання в різних видів тварин, не відрізняються по своїм культуральноморфологічним і ферментативним властивостям, але патогенність їх найбільш висока для того виду тварин, від якого вони виділені. Джерело збудника інфекції - хворі і перехворілі тварини. Зараження відбувається найчастіше через дихальні шляхи. У нашій країні факторний (ендогенний) пастерельоз молодняка сільськогосподарських тварин у вигляді ензоотій інфекційної пневмонії до теперішнього часу широко розповсюджений і наносить сільському господарству значний збиток. Важливе місце серед мір боротьби з пастерельозом займає вакцинопрофілактика. Відомий спосіб виготовлення сорбованої протипастерельозної вакцини, який включає суспензійне вирощування виробничих штамів пастерел, осадження отриманої культури 10% розчином алюмінієвих квасців та інактивацію 0,16-0,18% формаліном протягом 6 діб. [А.С.СССР №94044, кл. 30Н6, 17.02.51.] Недоліком вакцини, отриманої даним способом, є нетривалість імунітету у вакцинованих сільськогосподарських тварин. Відомий спосіб інактивації вірусів при виробництві вакцин проти вірусних захворювань в якому використовують в якості інактиванта етиленімін [А.С. СРСР №1594771 А61К39/12, 12N7/04, 07.07.93]. Недолік використання етиленіміна полягає в його високій токсчності, а також недоліком є те, що концентрації етиленіміну, використовувані для CO 5Г 7023 . інактивації вірусів не придатні для інактивації пастерел. Найбільш близьким до пропонованої корисної моделі, що до сукупності істотних ознак, є спосіб виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини, що включає одержання суспензії збудника, його інактивацію 0,5-4% розчином ацетилетиленіміна і наступне з'єднання інактивованого антигену з масляним ад'ювантом [патент РФ N2162339, кл. А61К39/102, A61L2/16, C12N1/00, 17.04.2000р.]. Недоліком способу є те, що отриманий препарат володіє порівняно невисокою імуногенною активністю при використанні його в Україні. Це обумовлено невідповідністю антигенних детермінант виробничих штамів Російського походження, епізоотичним варіантам, що циркулюють в Україні, що й приводить до зниження їх антигенної і імуногенної активності. Це рішення може бути прототипом. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити процес виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини, що включає одержання суспензії культури пастерел, інактивацію отриманої культури та з'єднання бактерійного антигену з масляним ад'ювантом шляхом використання як імуногенів штамів пастерел: Pasteurella multocida №3 серовар Д, №12 серовар А, №31 серовар В, які інактивують димером етиленіміном (ДЕІ), який вносять у суспензію культури до концентрації в межах 4-5% з корегованим рН 7,2-7,6, а по закінченні інактивації, отриманий антиген вносять у стабілізуюче середовище і з'єднують з масляним ад'ювантом, щоб забезпечити процес виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини. Технічний результат від використання коричної моделі полягає в підвищенні імуногенної активності і специфічності препарату шляхом підбору вітчизняних (регіональних) штамів і збереження вихідних властивостей білкових антигенів пастерел при інактивації. Зазначений технічний результат досягається створенням корисної моделі, охарактеризованої наступною сукупністю ознак: 1) процес виготовлення емульсійної вакцини проти факторного (ендогенного) пастерельозу молодняка с.-г. тварин; 2) одержання суспензії культури пастерел, що найменше, одного серовару із вітчизняних штамів; 3) інактивація отриманої культури; 4) як інактивант використовують димеретиленіміна (ДЕІ); 5) ДЕІ вносять у бактерійну суспензію в ефективній кількості; 6) ДЕІ вносять у бактерійну суспензію до концентрації 4-5% з корегованим соляною кислотою до рН 7,2-7,6; 7) інактивацію ведуть протягом 12-16 годин при 37-38°С; 8) осадження бактерійного антигену центрифугуванням; 9) розведення бактерійного антигену стабілізуючим середовищем; 10) як стабілізуюче середовище використовують сахарозо-желатинове середовище; 11) з'єднання бактерійного антигену з масляним ад'ювантом; 12) бактерійний антиген і масляний ад'ювант з'єднують у співвідношенні 3:7-1:1. Завдяки використанню пропонованого процесу отримана вакцина проти факторного (ендогенного) пастерельозу молодняка с.-г. тварин емульсійна інактивована, що володіє в порівнянні з прототипом, більш високою імуногенною активністю і специфічною безпекою. Досягнення технічного результату від використання пропонованого процесу зумовлюється тим, що використані високоімуногенні епізоотичні штами вітчизняного походження: Pasteurella multocida №3 серовар Д, №12 серовар А, №31 серовар В. Крім того, вакцина призначена для профілактики ензоотії інфекційної пневмонії телят і поросят пастерельозної етіології (факторна інфекція). Отже, пропонований процес відповідає умовам патентоспроможності та критерію "новизна". Процес виготовлення емульсійної вакцини виконується таким чином. Приклад 1 Для готування серії вакцини використовували З ампули із сухою культурою виробничих штамів Pasteurella multocida сероварів A, D і В. У кожну ампулу вносили 2-Зсм3 живильного середовища. Як живильне середовище використовували бульйон Хоттінгера з рН 7,2-7,6 і показником амінного азоту 200-250мг%. Отриманою рівномірною суспензією пастерел кожного серовару в обсязі 0,30,5см3 засівали по 2-3 флакона ємністю 100см3, утримуючих по 40-50см3 живильного середовища. Одночасно робили контрольні висіви кожної культури в пробірки з МПА, МПБ, МППБ під вазеліновою олією. Посіви культивували протягом 1216 годин при 37-38°С. У результаті одержали культуру першої генерації пастерел кожного серовару. Культури першої генерації досліджували мікроскопічне. Для одержання культури другої генерації чисту культуру першої генерації кожного серовару засівали по 5-15см3 кожного серовару на живильному середовищі в трьох-, п'яти- або десятилитрові бутилі зі змістом середовища 1/2 об'єму сулії з одночасним проведенням контрольного висіву в пробірки з МПА, МПБ, МППБ під вазеліновою олією й у бактеріологічні чашки з МПА. Матриксну культуру другої генерації у кількості, необхідному для засіву в реактор вирощували у термостаті протягом 6-8 годин при 37-38°С с 2-3 перемішуваннями культури протягом 1-2 хвилин. З вирощеної культури робили посіви в пробірки з живильними середовищами, чашки Петрі з МПА, проводили мікроскопію і визначали концентрацію мікробних клітин, які повинні бути не менш, ніж 109КУО/см. Для одержання бактеріальної маси матриксну культуру пастерел кожного серовару вносили в окремий реактор з живильним середовищем. Матриксну культуру вносили в об'ємі 510% від робочого об'єму реактора. Культивування вели при 37-38°С и рН 7,4-7,7 протягом 12 годин до одержання суспензії з концентрацією мікробних клітин 2-4x109КУО/см3. Для регулювання рН використовували розчини №гНРО4 і NaH2PO4. Вирощені культури пастерел кожного серовару за до 7023 помогою забуференного фізіологічного розчину приводили до єдиної найменшої концентрації, змішували у рівних пропорціях, перекачуючи в стерильний реактор. Отриману бактеріальну суміш піддавали інактивації, ДЕІ. Для цього в бактеріальну суміш вносили ДЕІ до концентрації 4-5%, і інактивували до 12 годин в умовах перемішування при 50-80об/хв і температурі 37-38°С. По закінченні інактивації антиген залишали при кімнатній температурі в стаціонарних умовах на 18-24 години. Контроль повноти інактивації здійснювали шляхом висіву вмісту реактора на бульйон і агар Хоттінгера і інкубування посівів при 37-38°С протягом 1824 годин. Росту бактеріальної мікрофлори на живильних середовищах не повинно було бути. Отриманий антиген очищали від баластових білків і ДЕІ, а також концентрували осадженням на проточній центрифузі. Концентрат антигену ресуспендували у сахарозо-желатиновому середовищу до концентрації 10-12КУО/см3 по 18 з оптичному стандартові ДІСК ім.Тарасовича. Після цього антиген з'єднували з масляним ад'ювантом. При цьому кількість водної фази, що містить антиген, складала в обсязі 30%, а масляного ад'юванта 70%. Для виготовлення емульсійної вакцини використовували колоїдні млини. Отримана вакцина являє собою емульсію білого кольору з жовтуватим відтінком, злегка грузлої консистенції, рН 7,2-7,6. При тривалому збереженні можливо незначне відшарування мінерального масла над не розшарованою однорідною емульсією. При ретельному струшуванні вакцина здобуває вид гомогенної маси. Приклад 2 Бактеріологічний контроль стерильності отриманої вакцини здійснювали наступним шляхом. Проби вакцини висівали на сироватковий бульйон і агар, рідке і щільне середовище Сабуро, МЛА, МПБ - по 3 пробірки, на МППБ - по 2 пробірки і 2 флакони, середовище Ендо - по 3 чашки. Для виявлення аеробів висівали по 0,5см3 вакцини в одну пробірку і 2см 3 в один флакон, а для виявлення анаеробів - відповідно по 1 і 5см 3 . Пробірки, 3 бактеріологічні чашки, флакони з посівами на всіх середовищах, крім Сабуро, витримували у термостаті при (37,0±0,5)°С, на середовищі Сабуро при (21,04±0,5)°С протягом 7 діб. Після закінчення зазначеного терміну робили пересівання, за винятком посівів на МПА, середовище Ендо, агар Сабуро і сироватковий агар. Пересівали проби на ті ж живильні середовища в тих же обсягах, що і при посіві. Вторинні посіви витримували 7 діб. Одночасно проводили контроль стерильності живильних середовищ. Результати первинного і повторного посівів оцінювали шляхом мікроскопічного дослідження посівів. Ріст мікроорганізмів на живильних середовищах був відсутній. Приклад З Контроль нешкідливості і реактогенності отриманої вакцини здійснювали наступним шляхом. Нешкідливість вакцин була перевірена на 6 морських свинках і 12 білих мишах. Препарат вводили підшкірне морським свинкам в області паху 1 і 2см, білим мишам в області спини в обсязі 0,5см3. Спо стереження за тваринами вели протягом 10 діб. Усі тварини залишилися живими. Для перевірки реактогенності препарат вводили внутрішньом'язево двом телятам і двом поросятам по 10см3. Через 14 днів після введення вакцини, у тварин на місці ін'єкції препарату збереглися місцеві зміни у вигляді ущільнення тканин, величиною від 1 до Зсм3. Ущільнення однорідні, без розм'якшення, безболісні. При розтині телят і поросят у товщі м'язевого шару виявлені ясно-жовтого кольору гранульоми щільної консистенції. Приклад 4 Для іспиту імуногенної активності стриманої вакцини на білих мишах використовували по 10 тварин на кожен серовар. Вакцину вводили ЗО білим мишам підшкірне в області спини в обсязі 0,1см3 (1,5млрд.м.к.) одноразово. Через 21 добу після імунізації по 10 вакцинованих і по 5 інтактних білих мишей заражали підшкірно попередньо відтитрованою смертельною дозою пастерел відповідного серовару. Серовар В вводили в дозі 35ж.м.к. на білу мишу (0,5см3 20-годинної бульйонної культури в розведенні 108 з накопиченням Імлрд.ж.м.к. у 1см 3 живильного середовища. Контрольні миші загинули протягом 24 годин. Вакциновані залишилися живими протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Серовар А вводили в дозі 10-20ж.м.к. на білу мишу (0,2см3 20годинній бульйонною культурою в розведенні 107 з накопиченням Імлрд.ж.м.к. у 1см3 живильного середовища. Контрольні миші загинули протягом 2436 годин. Вакциновані залишилися живими протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Серовар D вводили в дозі ЗООж.м.к. на білу мишу (0,3см 20-годинній бульйонної культури в розведенні 106 з нагромадженням Імлрд.ж.м.к. у 1см 3 живильного) середовища. Контрольні миші пали протягом доби. Вакциновані залишилися живими протягом 10 діб, спостереження після загибелі останньої контрольної білої миші. У висновку проведено оцінку вакцини кількісним методом. Приклад 5 Для іспиту імуногенної активності отриманої вакцини на кроликах використовували по 4 тварини на кожен серовар. Вакцину вводили 12 кроликам внутрішньом'язево в стегно в обсязі 0,5см3 (7,5млрд.ж.м.к.) одноразово. Через 21 день після імунізації по 4 вакцинованих і 2 інтактних кролика заражали внутрішньом'язево в стегно попередньо відтитрованою смертельною дозою пастерел відповідного серовару. Серовар В вводили в дозі 50ж.м.к. на одного кролика (0,5см 20-годинна бульйонна культура в розведенні 108 з накопиченням Імлрд.ж.м.к. у 1 см 3 живильного середовища). Контрольні тварини загинули протягом 24 годин. Вакциновані залишилися живими протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Серовар А вводили в дозі 50ж.м.к. на одного кролика (0,5см3 20-годинної бульйонної культури в розведенні 108 з накопиченням Імлрд.ж.м.к. у 1см 3 живильного середовища). Контрольні тварини загинули протягом 24-36 годин. Вакциновані залишалися живі протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Серовар D вводили в дозі 500ж.м.к. на одного кролика (0,5см3 20-годинної бульйонної куль 7023 тури в розведенні 10 з накопиченням Імлрд.ж.м.к. у 1см 3 живильного середовища). Контрольні тварини загинули протягом 6-7 діб. Вакциновані залишилися живими протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Приклад 6 Імуногенну активність вакцини на телятах і поросятах визначали шляхом прямого зараження вакцинованих тварин (доза щеплення 2см3, внутрішньом'язово). Через 21 добу після вакцинації тварини заражені 24-годинними бульйонними культурами пастерел: серовар В - 0,3см3; серовар А - 0,5см3; серовар D - 10см3. Контрольні тварини загинули, а вакциновані залишилися живими протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Комп'ютерна верстка Д. Шеверун 8 Приклад 7 Зроблено дослідження з порівняльного вивчення ефективності інактивованих протипастерельозних вакцин, отриманих на підставі вітчизняних виробничих штамів пастерел, на телятах і поросятах в умовах КСП "Україна" і "Росія" Іванівського району Херсонської області та учгосп "Комунар" і КСП "Пригородній" України. Досвід проведений на 1-3-місячних тваринах, термін спотереження - 6 місяців. Дослідження підтвердили високу імуногенність протипастерельозної вакцини з вітчизняних штамів. Таким чином, завдяки використанню пропонованого способу отримана вакцина проти факторного (ендогенного) пастерельозу молодняка с.-г. тварин емульсійна інактивована і володіє більш високою імуногенною активністю та специфічною безпекою. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601