Тест-система для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (віл 1/2) та анти-віл антитіл “dia-hiv-agat-s” підвищеної чутливості

Реферат: Тест-система для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (ВІЛ 1/2) та анти-ВІЛ антитіл „DIA-HIV-AgAT-S" підвищеної чутливості належить до біотехнології, імунохімії та медицини. UA 72006 U (12) UA 72006 U UA 72006 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для посилення чутливості імуноферментних тест-систем для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (ВІЛ 1/2) та анти-ВІЛ антитіл при скринінговому обстеженні зразків сироваток або плазми крові людини на наявність антитіл проти вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) і структурного білка р24 ВІЛ. Відома тест-система для виявлення антигену р24 ВІЛ і антитіл проти нього у сироватках і плазмі крові людини при діагностиці ВІЛ-інфекції і СНІДу [1]. В основі тест-системи лежать моноклональнї антитіла проти р24 ВІЛ і рекомбінантні поліпептиди аналоги антигенів ВІЛ, використані в складі імуносорбенту, а як кон'югат застосовані біотинільовані моноклональні анти-ВІЛ-антитіла та стрептавідин, зв'язаний з пероксидазою. Суть корисної моделі в створенні імуноферментної тест-системи підвищеної чутливості для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (ВІЛ 1/2) та анти-ВІЛ антитіл. Поставлена задача вирішується шляхом використання імуносорбенту з сорбованими моноклональними антитілами проти антигену р24 ВІЛ-1 та рекомбінантними поліпептидами аналогами-антигенів gp41 і gp120 ВІЛ-1, а також р36 і gp 110 ВІЛ-2. До складу кон'югатів застосовують біотинільовані моноклональні антитіла до інших епітопів р24 ВІЛ-1 і страптавідин, зв'язаний з перксидазою, а також рекомбінантні поліпептиди аналоги антигенів ВІЛ-1 і ВІЛ-2, мічені пероксидазою. Ампліфікація сигналу виконується за рахунок введення в систему біотинтираміну. Ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного однокомпонентного розчину з хромогеном. Приклад 1. Визначення наявності антигену р24 ВІЛ та анти-ВІЛ антитіл в сироватці крові хворої С, 1981 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього вносять в лунки імуносорбенту з фіксованими на ньому моноклональними антитілами проти р24 ВІЛ-1 та рекомбінантними поліпептидами аналогами-антигенів gp41 і gp120 ВІЛ-1 та р36 і gp 110 ВІЛ-2 досліджуваний матеріал - сироватку крові від хворої для визначення наявності ВІЛ-Інфекції та контрольні зразки (2 позитивних і 3 негативних). Потім у всі лунки вносять біотинільовані моноклональні антитіла до р24 ВІЛ. Накривають планшет кришкою та інкубують при температурі 42 C протягом 60 хв. Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки шість разів розчином для промивання планшетів. В лунки планшета вносять по 100 мкл розчину кон'югату - стрептавідину, інкубують планшет у термостаті 15 хв. при кімнатній температурі. Після відмивання лунок в них додають біотинтирамін на 15 хв., а потім знову кон'югат стрептавідину з пероксидазою та рекомбінантні поліпептиди ВІЛ-1 і ВІЛ-2, мічені пероксидазою, і інкубують ще 15 хв. Після відмивання 6 разів в лунки додають розчин проявника (однокомпонентний субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18-22 C у темряві 30 хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100 мкл стоп-реагенту. Досліджений матеріал від хворої було ідентифіковано як позитивний на наявність ВІЛінфекцІЇ. Результати визначення антигену р24 ВІЛ та анти-ВІЛ антитіл в сироватці хворої, отримані при застосуванні пропонованої тест-системи, порівнювали з даними, одержаними при використанні тест-системи "Genscreen Plus HIV Ag-Ab". Приклад 2. Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (по 20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у двох повторюваностях кожною тест-системою за описаною методикою. Обидві тест-системи по показнику виявлення антитіл до ВІЛ показали однакові результати: з 20 позитивних сироваток всі зразки виявлено як позитивні, що складає 100 % чутливості. З 100 негативних сироваток виявилися справді негативними 100 (специфічність – 100 %). Але при визначенні кількості виявленого білка р24 в зразках чутливість пропонованої тест-системи була вище. В таблиці наведені дані порівняння чутливості тест-систем за значенням співвідношення ОГ до ГЗ граничного значення ГЗ (ОГ/ГЗ) привиявленні білка р24 ВІЛ. 1 UA 72006 U Таблиця Порівняння чутливості тест-систем по кількості виявленого р24 ВІЛ Концентрація р24, пкг 1000 500 250 100 50 20 10 5 2,5 1,25 5 10 DIA-HIV-AgAT-S, ОГ/ГЗ 21,8 18,3 16,9 14,4 10,3 66 4,2 2,4 1,6 0,8 Genscreen Plus HIV Ag-Ab, ОГ/ГЗ 13,3 11,4 9,1 8,2 5,6 3,1 1,6 0,7 0,5 0,4 Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл до ВІЛ і до 2,5 пкг/мл антигену р24 ВІЛ-1. Проста і надійна в роботі. Джерела інформації: 1. Инструкция по применению тест-системи "Genscreen Plus HIV Ag-Ab-kit for drtection of HIV infection in human serum/plasma by enzyme immunoassay" виробництва "Bio-Rad" (Франція) 2003, 20 с. 2. Михайлов А. Т., Симирский В. Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М.: Наука, 1981. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Тест-система для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (ВІЛ 1/2) та анти-ВІЛ антитіл "DIA-HIV-AgAT-S" підвищеної чутливості, в якій на полістироловий планшет сорбовані антитіла проти антигену р24 ВІЛ-1 та очищені ВІЛ-1 і ВІЛ-2 антигени, а як кон'югат використовують біотинільовані анти-ВІЛ-1-антитіла та стрептавідин, зв'язаний з пероксидазою, яка відрізняється тим, що використовують імуносорбент з сорбованими моноклональними антитілами проти антигену р24 ВІЛ-1 та рекомбінантними поліпептидами аналогами-антигенів gp41 і gp120 ВІЛ-1, а також р36 і gp 110 ВІЛ-2, до складу кон'югатів застосовують біотинільовані моноклональні антитіла до інших епітопів р24 ВІЛ-1 і страптавідин, зв'язаний з пероксидазою, а також рекомбінантні поліпептиди аналоги антигенів ВІЛ-1 і ВІЛ-2, мічені пероксидазою, з підсиленням сигналу за рахунок введення в систему біотинтираміну, а ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного однокомпонентного розчину з хромогеном. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2