Спосіб оцінки активності аденілциклази клітин ізольованої крові

Спосіб оцінки активності аденілциклази клітин ізольованої крові, який включає постановку і реєстрацію реакції взаємодії клітинної тест-системи у вигляді суспензії клітин крові з речовиною - індуктором активності аденілциклази, зокрема, катехоламіном адреналіном, який відрізняється тим, що як клітинну тест-систему використовують стандартизовану гемолітичну систему у вигляді суспензії еритроцитів у підкисленому ізотонічному розчині натрію хлориду, при цьому до кювети з 0,5 мл стандартизованої зависі еритроцитів на рівні оптичної густини 0,70 в ізотонічному розчині натрію хлориду попередньо вносять 20 мкл розчину адреналіну, суміш інкубують упродовж 2 хв , після чого до кювети вносять ще 2,0 мл розчину соляної кислоти в концентрації 2 1 0 3 моль/л на ізотонічному розчині натрію хлориду і реєструють реакцію кислотного гемолізу (РКГ) фотометричним способом на стрічці самописця-мілівольтметра, а висновок про активність аденілциклази клітин ізольованої крові Корисна модель стосується медицини, зокрема біохімії, фізжо-хімп і цитологи, і може бути використана в практиці лабораторних діагностичних досліджень як чутливий і високоточний тест на ресурснють біоенергетики клітин крові в адаптаційних реакціях ЦІЛІСНОГО організму на пошкодження Відомий спосіб оцінки активності аденілциклази клітин ізольованої крові, який включає постановку і реєстрацію реакції взаємодії клітинної тестсистеми у вигляді суспензії клітин крові з речовиною - індуктором активності аденілциклази, зокрема, катехоламіном адреналіном [1] За відомим роблять за рівнем сповільнення гемолізу у порівнянні з контрольною реакцією, без попереднього введення адреналіну, користуючись формулою А =• (Д- к) то К де К - показник резистентності еритроцитів у контрольній РКГ, %, Д - показник резистентності еритроцитів у ДОСЛІДНІЙ РКГ, %, А - активність аденілциклази клітин ізольованої крові, у о , резистентність еритроцитів в РКГ визначають за формулою (Е2 -Е,) (Е3 - Е 2 ) (Е4 -Е,) (Е„ - Е . ,) п-1 де ( Е 2 - E j ) , ( E 3 - Е 2 ),...(Е П - Е п _,) - ряд R = 4 послідовних різниць екстинкцій суспензії еритроцитів у фотометричній кюветі за кожну хвилину РКГ у відсотках за умови Е п - Е 1 = 1 0 0 % , п - число похвилинних кроків реєстрації РКГ, R - показник резистентності еритроцитів, % t CM способом, взаємодія клітин крові, наприклад, лейкоцитів, супроводжується зміною термодинамічної рівноваги в ізольованій КЛІТИННІЙ тест-системі в кюветі, яку реєструють термометричним - термістометричним способом за рівнем розбалансування містка Ушстона на стрічці самописцямілівольтметра Недоліком відомого способу є недостатня чутливість, точність і клініко-лабораторна інформативність, що випливає з того, що активація аденілциклази функціонально інтактних клітин, відображає лише потенціальну спроможність фермент циклазної системи, а саме аденілциклази, до мобілізації 7241 в умовах норми або патологи, але в недостатній мірі відображає конкретну реакцію клітин на конкретне пошкодження Недостатній рівень точності відомого способу базується також на методичних труднощах стандартизації суспензії за концентрацією клітин, зокрема, лейкоцитів, а вирішення цього питання вимагає додаткових методичних прийомів, що ускладнює технологію способу В основу корисної моделі поставлено завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом використання стандартизованної клітинної тестсистеми, оптимізаци умов взаємодії її з індуктором активності ферментів циклазної системи і підвищення рівня об'єктивізації результатів тестової реакції досягають підвищення технологічності, точності та інформативності діагностичного дослідження При вирішенні технічного завдання було взято до уваги те, що гемоліз еритроцитів, у тому числі ініційований кислотним чинником, супроводжується мобілізацією біоенергетичних ресурсів адаптаційного спрямування Поетапна мобілізація вказаних біоенергетичних ресурсів визначається універсальною на клітинному рівні регуляторної системою, в основі якої лежить каталіз аденозинтрифосфорної (АТФ) кислоти у циклічний аденозинмонофосфат (цАМФ) Утворення останнього відбувається під впливом аденілциклази (АЦ), яка посідає центральне положення у координованому контролі синтезу і розпаду глікогену Ферментна активність АЦ індукується гормоном, зокрема, адреналіном [2] Саме з цим зв'язують сучасні уявлення про універсальну присутність цАМФ у всіх формах життя, його провідну роль в гормонозалежних механізмах регуляції біологічних процесів Важливим є те, що адреналін не проникає у клітину, а зв'язується з плазматичними мембранами і мобілізує активність АЦ Перетворення внутрішньоклітинної АТФ у цАМФ у присутності ІОНІВ Са і Мд серед каскаду адаптивних реакцій забезпечує мембранопротекторнчй ефект, який, зокрема, проявляється підвищенням резистентності еритроцитів до дії гемолітичного чинника Отже, за характером зміни кінетики гемолітичного процесу, ініційованого мобілізацією клітинної циклазної системи правомірно робити висновок про ресурсність - функціональну спроможність останньої, що може бути використано в діагностичному процесі для оцінки загального рівня неспецифічної адаптації організму до пошкодження як такого за умов норми і патологи 3 зазначених позицій оптимальною для виконання поставленої задачі слід вважати гемолітичну систему, до складу якої субстратом входить суспензія еритроцитів в ізотонічному розчині натрію хлориду, яка реалізується у вигляді реакції кислотного гемолізу (РКГ) Методичною перевагою, порівняно з прототипом, такого вибору, по-перше, є можливість стандартизації концентрації еритроцитів у суспензії за загальноприйнятою фотометричною методикою, а саме за показником оптичної густини По-друге, приготування суспензії еритроцитів в ізотонічному розчині натрію хлориду не вимагає застосування речовин - гемостабілізаторів, зокрема, таких як гепарин або натрію цитрат, здатних чинити самостійний вплив на мембранну рези стентність, - а це суттєво підвищує рівень точності фотометричного аналізу По-третє, і це - головне, еритроцити містять АТФ і АЦ - основні компоненти циклазної системи крові в КІЛЬКОСТІ, достатній для постановки діагностичної реакції Виходячи з наведеного, поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі оцінки активності аденіпциклази клітин ізольованої крові, який включає постановку і реєстрацію реакції взаємодії клітинної тест-системи у вигляді суспензії клітин крові з речовиною - індуктором активності аденілциклази, зокрема, катехоламіном адреналіном, ВІДПОВІДНО до корисної моделі як клітинну тестсистему використовують стандартизовану гемолітичну систему у вигляді суспензії еритроцитів у підкисленому ізотонічному розчині натрію хлориду, причому до кювети з 0,5мл стандартизованої зависі еритроцитів на рівні оптичної густини 0,70в ізотонічному розчині натрію хлориду попередньо вносять 20мкл розчину адреналіну, суміш інкубують упродовж 2 хв , після чого до кювети вносять ще 2,0мл розчину соляної кислоти в концентрації 2-Ю 3 моль/л на ізотонічному розчині натрію хлориду і реєструють РКГ фотометричним способом на стрічці самописця-мілівольтметра, а висновок про активність аденілциклази клітин ізольованої крові роблять за рівнем сповільнення гемолізу у порівнянні з контрольною реакцією - без попереднього введення адреналіну, користуючись формулою ( Д - К ) 100 К (1) де К - показник резистентності еритроцитів у контрольній РКГ, % , Д - показник резистентності еритроцитів у "ас ДОСЛІДНІЙ РКГ, % , Аас - активність аденілциклази клітин ізольованої крові, у о Резистентність еритроцитів в РКГ визначають за формулою 2 -EQ (Е3 -Е 2 ) (Е4 -Е 3 ) п-1 (Еп - Е ^ У (2) де (Е 2 - Еі), (Е3-Е2), (Еп - Еп і) - ряд послідовних різниць екстинкцій суспензії еритроцитів у фотометричній кюветі за кожну хвилину РКГ у відсотках за умови Еп-Еі = 100%, п - число по хвилинних кроків реєстрації РКГ, Re - показник резистентності еритроцитів, % Спосіб здійснюють наступним чином Готують суспензію еритроцитів, для чого 0,05мл крові змішують з Юмл ІЗОТОНІЧНОГО розчину натрію хлориду і стандартизують фотометричним способом до рівня оптичної густини 0,70 на фотоколориметрі (ФЕК) при зеленому світлофільтрі (540нм) Далі до стандартної фотометричної кювети об'ємом Змл вносять 1 Омл суспензії еритроцитів і додають 20мкл 0,01% розчину адреналіну і витримують упродовж 2 хв , після чого до кювети вносять 1,0мл розчину соляної кислоти в концентрації 2-Ю 3 моль/л на ізотонічному розчині натрію хлориду і реєструють реакцію кислотного гемолізу фотометричним способом на стрічці самописцямілівольтметра Резистентність еритроцитів Re в 7241 контрольній (К) і ДОСЛІДНІЙ (Д) тестовій РКГ визначають за формулою (2) f (Е3-Е2) (Е4-Е3) n-1 де (Ег-Е!), (E3-E2), (E n - En 1) - ряд послідовних різниць екстинкцій суспензії еритроцитів у фотометричній кюветі за кожну хвилину РКГ у відсотках за умови Еп-Еі = 100%, п - число похвилинних кроків реєстрації РКГ, Re - показник резистентності еритроцитів, % Висновок про активність аденілциклази клітин ізольованої крові роблять за рівнем сповільнення гемолізу у ДОСЛІДНІЙ реакції у порівнянні з контрольною, користуючись формулою _(Д-К)100 А к (1) де К - показник резистентності еритроцитів у контрольній РКГ, % , Д - показник резистентності еритроцитів у ДОСЛІДНІЙ РКГ, % , А ас - активність аденілциклази клітин ізольованої крові, у о Приклад 1 Кров з пальця людини в об'ємі 0,05мл внесли до пробірки з 1,0мл ІЗОТОНІЧНОГО розчину натрію хлориду Отриману суспензію стандартизували фотометричним способом, довівши іі оптичну густину до 0,70 при 540нм Після цього до фотометричної кювети об'ємом Змл внесли 1,0мл суспензії еритроцитів і додали 20мкл 0,01% розчину адреналіну. Через 2 хв до кювети внесли 1,0мл розчину соляної кислоти в концентрації 2-Ю 3 моль/л на ізотонічному розчині натрію хлориду і реєстрували реакцію кислотного гемолізу фотометричним способом на стрічці самописця-мілівольтметра Аналогічним чином зареєстрували контрольну реакцію - без адреналіну Резистентність еритроцитів Re в контрольній (К) і ДОСЛІДНІЙ (Д) тестовій РКГ визначали за формулою 2 (Е2 -EQ (Е3 - Е 2 ) (Е 4 - Е 3 ) п-1 (Е п - Е ^ У (2) де (Е 2 -Еі), (Е3-Е2), (ЕП - Еп і) - ряд послідовних різниць екстинкцій суспензії еритроцитів у фотометричній кюветі за кожну хвилину РКГ у відсотках за умови Еп-Еі = 100%, п - число похвилинних кроків реєстрації РКГ, Re - показник резистентності еритроцитів, % Отримані показники занесли в робочу таблицю 1, після чого користуючись формулою 2, вирахували показник Re для контрольної і дослідної реакцій, за допомогою формули 1 визначили активність аденілциклази клітин крові Аас Таблиця 1 (робоча) Діагностичні тестові проби Значення різниць послідовник вимірювань екстинкцій за кожну хвилину реєстрації РКГ, % Re,% п=1 Е2-Еі П=2 п=3 п=4 П=5 п=6 п=7 п=8 Е 3 -Е 2 Е 4 -Е 3 Е 5 -Е 4 Е 6 -Е 5 Е 7 -Е 6 Е 8 -Е 7 Ед-Е-ю Контрольна 5 7 9 20 38 14 7 44,5 Дослідна 5 7 10 16 24 17 14 7 75,2 Аас, УО Як видно з наведених у табл 1 даних, показник резистентності еритроцитів у контролі склав 44,5%, тоді як у ДОСЛІДІ він становив 75,2% Користуючись формулою 1, визначили показник активності аденілциклази 75,2 - 44,5 100 = 69уо 44,5 Приклад 2 3 метою визначення ефективності лікування опеченого хворого В , 42 років, з опіком окропом спини верхніх КІНЦІВОК ІІ-ІІІ А ступеня, 36% поверхні тіла, визначили активність аденілциклази клітин (переважно, еритроцитів) ізольованої крові Кров для дослідження брали на 2-й, 7 і 15 день після опіку, що співпадає з основними фазами патологічного процесу Результати дослідження наведені у таблиці 2 З наведених у таблиці даних видно, що активність аденілциклази клітин ізольованої крові, зокрема, еритроцит/в, відзначається фазним характером, що в цілому відповідає динаміці традиційного перебігу опікової травми Так, найнижчий рівень активності ферменту, очевидно, відображає 69 значні енерговитрати на клітинному рівні, пов'язані з втратою плазми крові через Таблиця 2 Динаміка активності аденілциклази клітин ізольованої крові у хворого з опіковою травмою за показником резистентності еритроцитів День дослідження ізольованої крові після термічного опіку 3 Показники Резистентність Активність еритроцитів в РКГ аденілциклази (Аас), У О Re, % Re, % (дослід) (контроль) 47,2 36,5 29,3 7 49,4 56,8 14,9 15 52,6 73,1 39,0 пошкоджену шкіру, електролітів та інших біологічно активних речовин Значною мірою 7241 біоенергетика клітин зазнає значних втрат, наприклад, у вигляді аденозинтрифосфату, у зв'язку з мобілізацією адаптаційних механізмів організму як цілого. Роль критеріального набирає показник активності АЦ на 6-7 день хвороби, що пов'язано з розвитком ендотоксемії. У наведеному прикладі підвищення активності АЦ, очевидно, слід розглядати як нарощування ресурсності циклазної системи організму в цілому за рахунок мобілізації інших регуляторних механізмів адаптації організму до пошкодження як такого, наприклад, за рахунок гальмування ферменту фосфодіестерази і збереження, в результаті, підвищеного вмісту цАМФ. Цілком імовірним є зв'язок мобілізації АЦ на 15 день хвороби, що очевидно, є наслідком інтенсивного перетворення внутрішньоклітинної АТФ у цАМФ як відображення ефективності лікувального процесу. Необхідний для реалізації зазначеного процесу вміст іонів Са і Мд в крові досягається в результаті адекватно проведеної комплексної терапії, у тому числі завдяки зниженню втрати електролітів плазми крові через пошкоджену поверхню тіла. Комп'ютерна верстка Г. Паяльніков 8 Таким чином, запропонований спосіб забезпечує вищий, ніж за способом-прототипом, рівень технологічності, точності та інформативності у визначенні активності провідного фермента циклазної системи крові, а саме аденілциклази клітин крові, перш за все - еритроцитів, і може знайти застосування в широкій клініко-лабораторній практиці, зокрема, для визначення динаміки патологічного і саногенетичного процесів у пошкодженому патологічним процесом організмі хворої людини. Джерела інформації, які слід взяти до уваги: 1. В.В. Дем'яненко, Г.О. Кривокульська, О.В.Саушева. Дослідження впливу екстракорпорального ультрафіолетового опромінення крові на активність циклазної системи лейкоцитів при експериментальній виразці шлунку/Яези обл. конф. "Нові методи діагностики, лікування і профілактики захворювань органів травлення. Тернопіль, 1990. С 41-43. 2. Л. Страйер. Биохимия. В 3-х томах. Пер. с англ. Р.Б. Капнер и A.M. Колчинского. Под ред. акад. С.Е.Северина. М: Мир, 1985. Т.2. - С.115137. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601