Тест-система імуноферментна “dia-c-hbv” для підтвердження наявності поверхневого антигену вірусу гепатиту в (hbsag)

Реферат: Тест-система імуноферментна "DIA-C-HBV" для підтвердження наявності поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HBsAg) включає використання як імуносорбенту і кон'югату моноклональних антитіл проти поверхневого антигену вірусу гепатиту В. Аналіз проводять в парних лунках. Після внесення в лунки зразків нерозведених досліджуваних сироваток і кон'югату в обидві лунки, в непарні лунки додають нейтралізаційний компонент - моноклональні антитіла проти HBsAg іншої специфічності, не зв'язані з пероксидазою, які інгібують взаємодію кон'югату з поверхневим антигеном вірусу гепатиту В і знижують значення оптичної густини зразка. UA 72507 U (12) UA 72507 U UA 72507 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для аналізу сироватки або плазми крові людини для підтвердження наявності поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HBsAg) методом імуноферментного аналізу. В Україні розроблена і випускається тест-система для виявлення поверхневого антигену (HBsAg) вірусу гепатиту В (DIA-HBV) виробництва НВК Діапроф-Мед [1]. Також відома тестсистема "Monolisa Ag HBs PLUS" виробництва "Sanofi Diagnostics Pasteur" (Франція) для детекції HBsAg вірусу гепатиту В методом імуноферментного аналізу [2], в якій на полістироловий планшет сорбовані моноклональні анти-HBsAg антитіла, а як кон'югат використовують антитіла проти HBsAg, мічені пероксидазою. В основу корисної моделі покладено задачу створити імуноферментну тест-систему для підтвердження наявності HBsAg вірусу гепатиту В у зразках сироватки або плазми крові. Суть корисної моделі в створенні тест-системи, що діє за принципом імуноферментного аналізу "сандвіч" варіанту для визначення поверхневого антигену вірусу гепатиту В і базується на принципі нейтралізації зв'язування кон'югату з поверхневим антигеном вірусу гепатиту В вільними антитілами нейтралізаційного компоненту. Поставлена задача вирішується шляхом використання імуносорбенту з сорбованими моноклональними антитілами (МКА-В6) проти HBsAg вірусу гепатиту В, кон'югату - МКА 95Е1 проти інших епітопів HBsAg, мічених пероксидазою і нейтралізаційного компоненту моноклональних антитіл до HBsAg, не зв'язаних з пероксидазою. Аналіз проводиться в парних лунках: після внесення в лунки по 100 мкл зразків нерозведених досліджуваних сироваток, а через 10 хв. - кон'югату в обидві лунки, до однієї лунки додають - нейтралізаційний компонент. HBsAg у випадку його наявності, зв'язується як зі специфічними антитілами на твердій фазі, так і з кон'югатом, утворюючи комплекси антигенантитіло. Після додавання нейтралізуючого компоненту в цій лунці відбувається інгібування утворення комплексу антиген-антитіло через зв'язування антигенних детермінант HBsAg моноклональними антитілами нейтралізаційного компоненту. Після відмивання незв'язаних компонентів в лунки додають розчин проявника. Пероксидазну реакцію зупиняють, додаючи стоп-реагент, і вимірюють оптичну густину суміші у лунках при довжині хвилі 450/620 нм, яка пропорційна концентрації HBsAg у зразках сироваток або плазми крові. Чутливість і підтверджувальна здатність тест-системи при перевірці її на панелі сироваток, що містять HBsAg, становить 100 %. Межа чутливості тест-системи при перевірці її з використанням стандарту HBsAg становить 0,1 нг/мл. Приклад 1. Визначення та підтвердження наявності HBsAg вірусу гепатиту В у сироватці крові хворої К., 1987 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [3] твердофазного імуноферментного аналізу. Дослідження однієї проби проводиться в парних лунках: після внесення в лунки по 100 мкл зразків нерозведених досліджуваних сироваток та контрольних зразків: по 2 позитивних і З негативних через 10 хв. додають кон'югат, а потім до однієї з парних лунок додають нейтралізаційний компонент. Накривають планшет кришкою та інкубують при температурі 37 °С протягом 2 годин. При наявності в зразку HBsAg, він зв'язується як з антитілами на підкладці так і з кон'югатом. Після відмивання 6 разів в лунки додають розчин проявника (однокомпонентний субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18-22 °С у темряві 30 хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100 мкл стоп-реагенту. В лунках з внесеним нейтралізуючим компонентом відбувається інгібування утвореного комплексу антиген-антитіло через зв'язування антигенних детермінант HBsAg моноклональними антитілами нейтралізаційного компоненту, що призводить до зниження оптичної густини забарвленого розчину в лунках. Не більш як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Значення ОГ зразка прямо пропорційне кількості HBsAg вірусу гепатиту В у сироватці. Досліджені сироватки хворої було ідентифіковано як позитивні на наявність HBsAg вірусу гепатиту В. Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення і підтвердження наявності поверхневого антигену вірусу гепатиту В у досліджуваному матеріалі. Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Використана література 1. Деклараційний патент UA 68755 А. Тест-система імуно-ферментна для визначення поверхневого антигену (HBsAg) вірусу гепатиту В (DIA-HBV) Семіноженко В., Шевчук О.Α., Горлов Ю.І та ін. 15.07.2004. бюл № 7. 2. Инструкция по применению тест-системи "Monolisa Ag HBs PLUS" виробництва "Sanofi Diagnostics Pasteur" (Франція), 2002, 17 c. 1 UA 72507 U 3. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. "Методы иммунохимического анализа в биологии развития". М. "Наука", 1981. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Тест-система імуноферментна "DIA-C-HBV" для підтвердження наявності поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HBsAg), у якій як імуносорбент і кон'югат використовують моноклональні антитіла проти поверхневого антигена віруса гепатиту В, яка відрізняється тим, що аналіз проводять в парних лунках: після внесення в лунки зразків нерозведених досліджуваних сироваток і кон'югату в обидві лунки, в непарні лунки додають нейтралізаційний компонент - моноклональні антитіла проти HBsAg іншої специфічності, не зв'язані з пероксидазою, які інгібують взаємодію кон'югату з поверхневим антигеном вірусу гепатиту В і знижують значення оптичної густини зразка. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2