Спосіб кріоконсервування еритроцитів

Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів включає дозоване додавання до них кріозахисного розчину, що містить кріопротектор оксіетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 25. В кріозахисний розчин додатково вводять кріопротектор диметилацетамід при співвідношенні кріопротекторів 1:1, а додавання кріозахисного розчину здійснюють зі швидкістю 10 мл/хв. UA 75333 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ЕРИТРОЦИТІВ UA 75333 U UA 75333 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до кріобіології і кріомедицини і може бути використана в трансфузіології. Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів шляхом заморожування до - 196 °C у присутності кріопротектора гліцерину [1]. Недоліком цього способу є необхідність видалення кріопротектора з розморожуваного матеріалу і перенесення в ізоосмотичне середовище, що спричиняє додаткову втрату клітин, а також ускладнює технологію кріоконсервування. Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів з оксіетильованим гліцерином зі ступенем полімеризації n=25 (ОЕГn=25) [2]. Згідно зі способом, до клітин перед заморожуванням додають одноразово при кімнатній температурі 30 %-ий сольовий розчин кріопротектора і після 30 хв. витримування заморожують до -196 °C шляхом занурення у рідкій азот. Недоліком цього способу є недостатньо високі показники схоронності еритроцитів після заморожування-відтавання. Після розморожування у середньому зберігається 80-85 % клітин, показники осмотичної крихкості після перенесення в ізотонічне і гіпотонічне середовище становлять 15-20 %. Найбільш близьким до заявленого способу є спосіб кріоконсервування еритроцитів в кріозахисному розчині, що містить 30 % кріопротектор оксіетильований гліцерин зі ступенем полімеризації n=25 (ОЕГn=25) [3]. Згідно зі способом, до клітин дозовано, при кімнатній температурі, додають кріопротектор зі швидкістю 0,36 мл/хв., витримують 50-60 хв. і далі заморожують у шузі азоту. Однак цей спосіб не забезпечує достатньо високої схоронності еритроцитів. Це обумовлено використанням одного кріопротектора ОЕГ n=25 та тривалістю процесу додавання кріопротектора до еритроцитів, що призводять до підвищення осмотичної крихкості. Крім цього, тривале додавання (до 9 год.) ОЕГn=25 до еритроцитів ускладнює технологію кріоконсервування. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів таким чином, щоб забезпечувалась можливість підвищити схоронність клітин, а також спростити технологію кріоконсервування. Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування еритроцитів, який включає дозоване додавання до них кріозахисного розчину, що містить кріопротектор ОЕГ n=25, згідно з корисною моделлю, в кріозахисний розчин додатково вводять кріопротектор диметилацетамід (ДМАЦ) при співвідношенні кріопротекторів 1:1, а додавання кріозахисного розчину здійснюють зі швидкістю 10 мл/хв. Заявлений спосіб дозволяє підвищити схоронність еритроцитів за рахунок використання комбінації 2-х кріопротекторів: проникаючого (ДМАЦ) та непроникаючого (ОЕГ n=25), а також використання більш високих швидкостей додавання кріозахисного розчину до еритроцитів. Так, крихкість еритроцитів знижується на 2,35-7,17 % у порівнянні з прототипом. Крім цього, час додавання кріозахисного розчину до клітин зменшується до 20 хв., що спрощує технологію кріоконсервування. Спосіб здійснюють таким чином. До еритроцитів, отриманих з донорської крові людини, зі швидкістю введення 10 мл/хв. при кімнатній температурі додають кріозахисний розчин, що містить ОЕГ n=25+ДМАЦ, який приготовлений на фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) з рН 7,4. Сумарна концентрація кріопротекторів при цьому складає 30 % при їх співвідношенні 1:1. Одержану суспензію переносять у поліетиленові ампули місткістю 2 мл і заморожують у рідкому азоті до -196 °C. Зразки відігрівають на водяній бані при температурі 40 °C протягом 30 сек. Приклад. Еритроцити отримували з донорської крові людини, заготовленої на гемоконсерванті "Глюгицир", яка зберігалася після ексфузії не більше 2 діб при +4 °C. Кріозахисний розчин, що містить суміш кріопротекторів ОЕГn=25 та ДМАЦ, який приготовлений на ФСБ у 30 % концентрації, додавали зі швидкістю 10 мл/хв. до еритроцитів і заморожували в поліетиленових ампулах місткістю 2 мл у рідкому азоті (-196 °C). Зразки відігрівали на водяній бані при температурі 40 °C протягом 30 сек. Далі визначали осмотичну крихкість еритроцитів, яка є головним показником їх схоронності. Величину осмотичної крихкості еритроцитів у 0,9 % розчині NaCl вимірювали спектрофотометричним методом за довжини хвилі 540 нм та розраховували відносно 100 % гемолізу [4]. Результати наведені в Таблиці у порівнянні з прототипом. З таблиці видно, що практично при однакових значеннях кількості збережених клітин і гематокриту, осмотична крихкість еритроцитів у заявленому способі знижується на 2,35-7,17 % у порівнянні з прототипом. 1 UA 75333 U Таблиця Показники збереження еритроцитів в залежності від способу кріоконсервування Параметри Спосіб кріоконсервування Заявлений Прототип 10 0,36 20 хв. 9 год. 15хв 90-95 89-94 4,1±0,54 8,86±2,95 26,3±2,02 22,3±1,24 Швидкість введення, мл/хв. Час додавання Кількість збережених клітин, % Осмотична крихкість у 0,9 % NaCl, % Гематокрит, % 5 10 Джерела інформації: 1. Виноград-Финкель Ф.Р., Федорова Л.И., Семенова Н.В. и др. Усовершенствование криоконсервирования эритроцитов при ультранизких температурах /Проблемы гематологи и переливания крови.-1980. - № 9. - С. 19-23. 2. Лубяный В.Г., Бредихина Л.П., Шраго М.И. Криопротекторная активность олигомеров ОЭГ в низкотемпературном консервировании эритроцитов // Криобиология и криомедицина.- Вып. 8. - С. 34-40. 3. Пат. України № 24710, МПК А01N 1/02, публ. 10.07.07. 4. Идельсон Л.И. Справочник по функциональной диагностике.- М.: Медицина, 1970. - С. 119-120. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб кріоконсервування еритроцитів, який включає дозоване додавання до них кріозахисного розчину, що містить кріопротектор оксіетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 25, який відрізняється тим, що в кріозахисний розчин додатково вводять кріопротектор диметилацетамід при співвідношенні кріопротекторів 1:1, а додавання кріозахисного розчину здійснюють зі швидкістю 10 мл/хв. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2