Застосування 4-(n-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодиду (амізон) як інгібітора коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней

Застосування 4-(N-бензил)амінокарбоніл-1метилпіридиній йодиду (амізон) загальної формули O NH C CH2 C6H5 I + N CH3 як інгібітора коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней. O C6H5 I+ N CH3 в якості інгібітора коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней. Амізон виявляє вірусостатичну дію щодо коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней, що забезпечує її специфічну дію проти цього збудника та звільнення організму від вірусоносія. Ліки можуть застосовуватись у формі порошку або водного розчину і добавлятися до Їжі, що виключає необхідність ін'єкційного внутрішньомязового введення. Відоме застосування амізону в медицині як знеболюючого засобу з інтерфероногенними, протизапальними та жарознижуючими властивостями (Патент України №6752, Кл. А61К31/44, C07D213/20, публ. 1994р.] для лікування тяжких ускладнень форм епідемічного паротиту [Патент України №38388, Кл. А61Р31/00, публ. 2001р.], для лікування ангін [Патент України №40248, Кл. 75813 CH2 (11) NH UA C (19) Винахід стосується вірусології, і може бути використаний для профілактики та лікування коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ВТГЕС). Відомі способи профілактики та попередження ВТГЕС [Патент РФ №2028804, Кл. А61К31/115, публ.1995р. Патент РФ №2035190, Кл. А61К39/12, публ. 1995р.] розчином формаліну, який вводять внутрішньо м'язово. Під дією внутрішньо м'язових ін'єкцій формаліну відбувається зміна природнього фону метаболічного формальдегіду, який впливає на збудника захворювання. Такий спосіб спрямований на лікування або профілактику трансмісивного гастроентериту свиней і має на меті підвищення активності імунної системи свині, проте не може забезпечити санацію(звільнення) організму тварин від коронавірусу. В основу винаходу поставлене завдання винайдення засобу, що інгібує реплікацію коронавірусу та забезпечує звільнення організму від вірусоносія. Поставлене завдання досягається застосуванням 4-(N-бензил) амінокарбоніл-1метиллірідіній йодиду (товарна назва "Амізон") загальної формули (13) C2 (21) 20040907941 (22) 30.09.2004 (24) 15.05.2006 (46) 15.05.2006, Бюл. № 5, 2006 р. (72) Жебровська Філя Іванівна, Фролов Аркадій Федорович, Маргітич Віктор Михайлович, Мочалін Ігор Олександрович (73) ВІДКРИТЕ АКЦІОНЕРНЕ ТОВАРИСТВО "ФАРМАК" (56) RU 2118529, C1, 10.09.1998 EP 0930316, A1, 21.07.1999 WO 03041639, A2, 29.10.2002 2 3 75813 4 А61К31/44, публ. 2001р.], вірусного гепатиту А [ПаПрофілактична дія амізону вивчали у експетент України №21337, Кл. А61К35/14, публ. рименті, до якого увійшло шість груп: 2001р.]. 1. Контрольна І - для спостереження за ростом В результаті проведених досліджень виявлеклітин СНЕВ у культурі. но, що введення амізону у дозах 80-160мкг/мл у 2. Контрольна ІІ - для спостереження росту культуру первинних клітин нирки ембріону свині, клітин при додаванні 80мкг/мл амізону. що інфікована вірусом трансмісивного гастроенте3. Контрольна ІІІ - для дослідження стану кліриту свиней (належить до родини короновірусів), тин у процесі експерименту під дією ВТГЕС, який протягом 2-х - 3-х діб гальмує його утворення та додавався у культуру у інфікуючій дозі 4,5 lg ураження ним клітин. Цей ефект зберігається, якТЦД50. що у культуру повторно через дві доби вводиться 4. Піддослідна група, у якій на третій добі росу тій же дозі препарат амізон. Відсутність цього ту культури клітин додавався препарат амізон у призводить вже з другої-третьої доби спостередозі 80мкг/мл, а на наступну добу інфікували ження до активації введеного раніш вірусу. ВТГЕС у дозі 4,5lgТЦД 50. Тимчасовий, гальмуючий вплив амізону на 5. Піддослідна група - амізон вводили двічі, утворення досліджуваного коронавірусу in vitro, другий раз через добу після зараження клітин розвиток інфекційного процесу у інфікованих кліВТГЕС. тинах може бути пов'язаний з безпосереднім 6. Піддослідна група, в якій дозу амізону, що впливом амізону на вірусну частку (віріон), модивводився одноразово, за добу до зараження кліфікацію ним поверхні чутливої клітини та зниження тин, збільшили до 160мкг/мл. Основні результати, її здатності до адсорбції віріонів коронавірусу або що одержані у цій серії експериментів, подані у індукцією амізоном здатності клітин СНЕВ до протаблиці 1. дукції інтерферону. Як видно з таблиці 1 у перших двох групах екПриклад. Вплив препарату амізон на репродусперименту проявів порушення росту моношару кцію коронавірусу трансмісивного гастроентериту клітин протягом періоду спостереження не встаносвиней (ВТГЕС). влено. У третій групі після інфікування на другу Досліди проводили на короновірусі свині, добу у 25% досліджуваних груп клітин візуально штам Пурдью-115 (збудник трансмісивного гастбули виявлені ознаки цитопатичної дії вірусу у вироентериту свиней (ВТГЕС). Вірус пасувався у гляді порушень цілісності моношару, зміни форми культурі клітин нирок ембріону свині (СНЕВ). Інфеклітин СНЕВ з фібропласто- та епітеліоподібної на кційний титр при одержанні становив 5,5 lgТЦД. кульоподібну, зменшену у розмірі і не здатну до Культура клітин була адаптована для роботи з пропускання світла (сіру та чорну). Як з'ясувалося амізоном насувалась на живильному середовищі згодом на підставі їх здатності до забарвлення це складу: ДМ ЕМ, 10% сироватки ембріону корови, були не життєздатні клітини. У четвертій групі 50мкг/мл гентаміцину, 2мл глютамину/300мкг/мл/. профілактичне, попереднє введення амізону заПосадкова доза становила 200тис. клітин на 1мл тримало до третьої доби прояви ЦПД вірусу, які середовища. Інкубація проводилась при темперавиникли у 33,3% культур. турі 36,5°С, відносно вологості 70%: протягом П'ята група експерименту, амізон в котрій у двох-трьох діб формувався моношар клітин, що дозі 80мкг/мл вводили двічі (другий раз після завикористовувався для подальшої роботи. Амізон раження культур вірусом), характеризується відсубуло одержано у вигляді 2,5% водного розчину. тністю ЦПД протягом трьох діб, тобто на дві доби Критеріями оцінки дії амізону слугували: тердовше ніж у третій групі (вірусній). У шостій групі мін розвитку тканевої цитопатичної дії (ТЦД), віддозу амізону було збільшено у двічі (з 80мкг/мл, які соток культур, в яких виявилась цитопатична дія застосовувалися у четвертій та п'ятій групах, до амізону, співвідношення життєздатних та нежиттє160мкг/мл), але схема застосування була викорисздатних (для вірусу) клітин СНЕВ у різних групах тана аналогічна до схеми четвертої групи. Як виексперименту. явилося, гальмування розвитку ЦПД продовжилоДосліди проводили у напрямку вивчення прося на дві доби, тобто на одну добу довше ніж в філактичної, лікувальної та профілактичнотретій (контрольній вірусній) групі. Таким чином лікувальної дії амізону. Всього проведено 12 серій можна вважати, що препарат амізон, який застоексперименту, кожна з яких складалася з контросовувався у дозі 80мкг/мл за добу до інфікування льних (росту клітин, дії амізону на клітини, репрокультур клітин вірусом трансмісивного гастроентедукції ВТГЕС) та піддослідних груп. риту свиней протягом наступних двох діб гальмує Вивчення доксичної дії амізону на культуру ураження клітин яке виявляється у їх культурі розклітин СНЕВ показало, що в дозах препарату витком ЦПД. Повторне введення амізону подовжує 800мкг, 80мкг, 8мкг на 1мл середовища, які найчаефект гальмування прояву дії вірусу, порівняно з стіше використовувалися у роботі, його токсичної третьою (вірусною) групою на дві доби. Збільшендії встановлено не було, відношення кількості житня дози амізону у двічі (160мкг/мл замість тєздатних та нежиттєздатних клітин, які вирахову80мкг/мл) суттєво не позначилось на його профівалися протягом експерименту, у порівнянні з конлактичній дії. тролем, суттєво не відрізнялись. На першій добі Крім вивчення профілактичної дії амізону досвони коливалися у межах 7,75%-9,1%, на п'ятійліджувалися його здатність впливати на перебіг шостій, коли вже почалося відмирання чергового вірусної інфекції у культурі клітин із застосуванням пасажу клітин, внаслідок їх старіння, ці показники лікувальної схеми використання цього препарату. збільшувалися до 38,66-46,15% у дослідних групах Схема включала досліди по одночасному введенпроти 7,37% у контрольній. ню препарату за добу після інфікування клітин та 5 75813 6 двічі після цього. Амізон додавали у дозі 80мкг/мл. 2-3-ох діб після його введення в культуру клітин, Результати наведені у таблиці 2. пізніше у останніх виявляються ознаки активації З даних таблиці 2 видно, що одночасне ввевірусу яким Їх було інфіковано. При цьому має дення амізону у дозі 80мкг/мл і вірусу трансмісивзначення ступінь розведення вихідної культурального гастроентериту свиней призводить до гальної рідини. У другій та третій групах вона станови-6 -5 мування утворення цього збудника у культурі ла 10 , а у четвертій - 10 , що позначилося на клітин (група II досліду). Внаслідок цього цитопайого (вірусі) визначенні. Якщо при більшому стутична дія досліджуваного вірусу вже після другої пеню розведення (менша інфікуюча доза збуднидоби виявляється у меншої кількості культур і стака) вірус на другій добі у культурі клітин зафіксоновить 50 та 66,6 відсотків протягом 6-го та 7-го ваний не був, то зараження клітин більшою кількісдня спостережень. У той же час у першій групі (кокількістю вірусу (розведення 10-5, четверта група нтроль вірусу) відповідні показники становлять 100 досліду) призведе до проявів цитопатичної дії дота 100 відсотків. сліджуваного збудника. Третя група цієї серії дослідів по суті відтвоВведення амізону у дозах 80-160мкг/мл у курює профілактичне та лікувальне застосування льтуру первинних клітин нирки ембріону свині, що амізону. Ефективність комбінованої схеми аналіінфікована вірусом трансмісивного гастроентериту зувалася з матеріалами таблиці 1. У даному випасвиней (належить до родини короновірусів), протядку, стосовно таблиці 2, слід підкреслити, що одгом 2-х - 3-х діб гальмує його утворення та ураночасне та однократне використання амізону ження ним клітин. Цей ефект зберігається, якщо у зменшує прояви цитопатичної дії вірусу до 50,0культуру повторно через дві доби вводиться у тій 66,6% протягом шостої-сьомої діб спостереження же дозі препарат амізон. Відсутність цього призвопроти 100,0% у контрольній (вірусній) II групі досдить вже з другої - третьої доби спостереження до ліду. активації введеного раніш вірусу. У проведених експериментах було досліджено Тимчасовий, гальмуючий вплив амізону на значення дози інфікуючого вірусу у виявленні здаутворення досліджуваного коронавірусу in vitro, тності амізону до гальмування утворення вірусу розвиток інфекційного процесу у інфікованих клітрансмісивного гастроентериту свиней у культурі тинах може бути пов'язаний з безпосереднім клітин СНЕВ. З цією метою для зараження культувпливом амізону на вірусну частку (віріон), модири клітин була використана інфікуюча доза ВТГ у фікацію ним поверхні чутливої клітини та зниження 1,1 lg TЦД50. Одержані результати наведені у її здатності до адсорбції віріонів коронавірусу або таблиці 3. індукцією амізоном здатності клітин СНЕВ до проУ цій серії дослідів схеми застосування амізодукції інтерперона. ну були ідентичними з тими, що використовувалиТаким чином виявлено, що амізон здатний до ся у серії вивчення профілактичної дії амізону вірусостатичної дії щодо вірусу трансмісивного (таблиця 1). Перша доба спостереження за цитогастроентериту свиней. патичною дією амізону в жодній з груп не визначиПрофілактичне застосування амізону (доза ла його ознак, тому у таблиці наведені результати 80мкг/мл за добу до зараження клітин СНЕВ віру2, 3 та 4 діб. Як видно з таблиці 3 на другу добу, а сом трансмісивного гастроентериту свиней) гальтакож на третю були зафіксовані ознаки цитопатимує інфекційний процес протягом трьох діб у 66,6чної дії вірусу саме у II групі, при цьому лише при 100,0 відсотках досліджуваних культур клітин. Збійого титрі у 0,11 lg TЦД 50 (розведення 10-1). У льшення дози амізону до 160мкг/мл суттєво не групах піддослідних (III та IV) це виявилося лише позначається на тривалості вірусостатичного ефена четвертю добі експерименту, у 66,6% випадків кту препарату. культур клітин взятих до експерименту. Це може Терапевтична схема (одночасне введення в бути пов'язане з дією амізону. культуру клітин амізону та ВТГЕС) при застосуВраховуючи результати попередніх досліванні амізону в дозі 80мкг/мл зменшує кількість джень та виявленого факту перебування ВТГЕС у уражених вірусом культур клітин протягом 3-4 діб культурі клітин дослідних груп з подальшою актипісля їх інфікування до рівня 50,0-66,6 відсотків вацією його у вигляді цитопатичної дії, було про(показники контролю - 100 та 100 відсотків). ведено визначення можливої наявності його у лаНайбільш ефективною є схема, яка поєднує тентному стані. Для цього було проведено профілактичне та терапевтичне застосування амівизначення збудника в культуральній рідині дослізону. Це дає змогу захищати культуру клітин СНЕВ джувальних груп експерименту з використанням від цитопатичної дії ВТГЕС протягом чотирьох діб вірусу у титрі 1,1 lg TЦД 50. Результати наведені у з моменту їх інфікування. У контролі цей час статаблиці 4. новить дві доби. Схема передбачає: введення Експерименти, результати яких наведені у амізону (80мкг/мл), наступна доба-інфікування таблиці 4, свідчать про те, що незважаючи на відклітин, друга доба - повторне введення амізону сутність цитопатичного ефекту у піддослідних гру(80мкг/мл). пах з застосуванням амізону, як правило, протягом 7 75813 8 Таблиця 1 Результати дії амізону на культуру клітин СНЕВ за профілактичною схемою Доба спостережень Результати досліджень (% культур клітин з ЦТД) 25,0 100,0 100,0 33,3 хх_ 50,0 Група І II III IV V VI х_ хх_ хх_ хх_ _х _х _х 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 - - відсутність цитопатичної дії х - введення вірусу у культуру клітин х - введення амізону у культуру клітин Таблиця 2 Група1 2 І II III Результати застосування лікувальної схеми використання амізону Доба спостережень 3 4 5 6 7 Результати досліджень (% культур клітин з ЦПД) _х 25,0 100,0 100,0 хх+х 25,0 50,0 66,0 _хх _х _хх 8 9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 - - відсутність цитопатичної дії х - введення вірусу у культуру клітин хх - введення амізону у культуру клітин Таблиця 3 Доба спостережень 3 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Результати досліджень (%% ЦПД) II 100,0 66,6 66,6 III 66,6 IV 66,6 Група 2 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 І 4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 - - відсутність ефекту І - група контролю росту клітин СНЕВ II - група контролю росту вірусу у клітинах II - профілактична дія амізону (доза 80мкг/мл) ІІІ - профілактична дія амізону (доза 160мкг/мл) Таблиця 4 Визначення наявності ВТГЕС у культуральній рідині культур СНЕВ піддослідних груп Група І II III IV -5 10 2 10-6 10 10 100 100 100 100 100 33,3 100,0 100,0 100,0 100,0 -7 -5 Доба спостережень 3 -6 10 10-7 10-5 Результати досліджень (%% ЦІІД) 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 4 10-6 10-7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 66,6 100,0 I - група контролю ВТГЕС II - група культуральної рідини з культур дослідження профілактичної дії (амізон 80мкг/мл+ВТГЕС), інфікуюча доза 10-6). III - група культуральної рідини з культур дослідження профілактичної дії (амізон 160мкг/мл+ВТГС - інфікуюча доза 10-6). IV - група культуральної рідіни з культур дослідження профілактичної дії (амізон 80мкг/мл+ВТГС -інфікуюча доза 10-5). Комп’ютерна верстка Н. Лисенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 100,0 Н/Д Н/Д