Спосіб приготування цитологічних препаратів дендритних клітин

Спосіб приготування цитологічних препаратів дендритних клітин, що включає висушування ци 3 76372 4 клітин суспензія постійно піпетується за допомозапобігання злипання клітин суспензія постійно гою піпетки об'ємом на 1,0мл. При цьому піпетується за допомогою піпетки об'ємом на співвідношення клітинної суспензії і спирту 1,0мл. Потім наносять шар дендритних клітин із дорівнює 1:2,5. Для отримання якісного суспензії з фіксуючим розчином на підготовлене за цитологічного препарату клітинна суспензія подопомогою полі-L-лізину або бичого сироваткового винна містити дендритні клітини у кількості 1альбуміну предметне скло з наступним висушуванням клітинного матеріалу на повітрі. 2 106 в 1мл. Підрахунок числа дендритних клітин Зафіксовані дендритні клітини фарбують за метоздійснюється в камері Горяєва. дом Паппенгейма: спочатку мазок фарбують фарДругий етап приготування цитологічного пребою-фіксатором Май-Грюнвальда 3 хвилини, потім парату дендритних клітин включає нанесення шадодають таку ж кількість дистильованої води, черу дендритних клітин із суспензії з фіксуючим розрез 1 хвилину фарбу зливають і наливають робочином на підготовлене предметне скло з чий розчин готової фарби Романовського-Гімзи наступним висушуванням на повітрі. Підготовка (при рН 6,8) на 2 хвилини. За підготовленими тапредметних скелець заключається в нанесенні на ким чином цитологічними препаратами дендритних шару полі-L-лізину або бичого сироваткового них клітин проводять мікроскопічне дослідження альбуміну. Зазначеного об'єму суспензії дендритпри збільшенні х400 та в імерсійній системі при них клітин достатньо для виготовлення одного збільшенні х1000. цитологічного препарату. В цитограмах дендритних клітин, одержаних з На третьому етапі приготування цитологічного селезінки мишей, виявляється велика кількість препарату зафіксовані таким чином дендритні клідрібних округлих клітин, розташованих порізно, в тини фарбують за методом Паппенгейма: спочатку групах та пластах (Фіг.1). Вони мають тонку, без мазок фарбують фарбою-фіксатором Майчітких контурів слабобазофільну цитоплазму з Грюнвальда 3 хвилини, потім додають таку ж кільвідростками, які радіально відходять від ядерної кість дистильованої води, через 1 хвилину фарбу оболонки, конденсуються в перінуклеарній зоні і зливають і наливають .робочий розчин готової розріджуються в напрямку до краю цитоплазми. В фарби Романовського-Гімзи (при рН 6,8), при цьоцитоплазмі виявляється невелика кількість дрібних му експериментальним підбором визначено, що і середніх вакуолей. Кожна клітина містить по одоптимальним часом фарбування останньою фарному гіперхромному округлому ядру з нерівним бою є 2 хвилини. контуром оболонки, з рівномірною компактною Таким чином, при використанні запропоноваструктурою хроматину, ядерця не виявляються. ного винаходу забезпечується фіксація дендритЯдерно-цитоплазматичне співвідношення станоних клітин до предметного скла, яка зберігає їх вить приблизно 1:1,5. морфологічну структуру, а дотримання оптимальII. Цитологічне дослідження дендритних кліної методики і часу фарбування дозволяє візуалітин, одержаних з периферичної крові хворих на зувати дендритні клітини і вивчати їх цитоморфорак яєчників і меланому. логічні властивості. Для виділення дендритних клітин з перифериПереконливим доказом ефективності застосучної крові хворих на рак яєчників і меланому у вання запропонованого способу є два приклади хворих при задовільних клініко-лабораторних поцитологічних досліджень дендритних клітин: казниках забирається 50мл периферичної крові у І. Цитологічне дослідження дендритних клітин, стерильний флакон ємністю 250мл з додаванням одержаних з селезінки мишей. 25Од/мл гепаріну ("Біохемі"). Потім кров Для виділення дендритних клітин з селезінки відстоюють терміном 40 хвилин при 20-22°С для інтактних мишей ліній СВА та C57BL/6 подрібнювідсепарування лейкоцитарної маси з плазмою від ють препаровані селезінки мишей в середовищі еритроцитарної маси. Для виділення RPMI 1640 (фірми "Sigma") та фільтрують крізь лейкоцитарної маси від плазми отриману рідину нейлоновий фільтр для отримання однорідної кліцентрифугують 10 хвилин при 1500об/хв. Потім до тинної маси. Клітини в концентрації 5х106 на 1мл 5мл лейкоцитарної маси додають 2мл фікола і середовища RPMI 1640 інкубують при 37°С та 5% знову центрифугують, при цьому від CO2 терміном 24 години в повному середовищі лейкоцитарної маси відсепаровуються мононукRPMI 1640 з додаванням 10% ембріональної телеари. Ці клітини поміщаютьв середовище кульлячої сироватки, 200ммоль/л глютаміну, 100од/мл тивування (середовище RPMI 1640, фірми "Sigma" пеніциліну, 100мкг/мл стрептоміцину та 25ммоль з 2мМ L-Gly, 100мкг/мл стрептоміцина та 100од/мл 5-меркаптоетанолу. Потім до отриманої суспензії пеніциліна) та інкубують в пластиковому флаконі культивованих клітин в кількості 5мл додають 2мл Т25 при 37°С та 5% СО2 терміном 2-3 години і та14,5% метризаміду і центрифугують 15 хвилин при ким чином отримують генерацію моноцитів і 1000об/хв, що дозволяє відсепарувати дендритні лімфоцитів. Лімфоцити змивають попередньо клітини на поверхні цієї речовини, а інші клітини прогрітим середовищем культивування, а моноциосідають на дно пробірки. Отримані дендритні кліти завдяки адгезивним властивостям залишаютьтини відмивають розчином Рінгера шляхом ся на чашці Петрі. Потім до моноцитів додають центрифугування терміном 5 хвилин при середовище культивування та 1% аутологічної 1000об/хв. Суспензію дендритних клітин розводять (відсепарованої раніше) плазми і 100 ng на 1мл розчином Рінгера до концентрації 1-2 106/мл і гоцього середовища ростового фактору ГМ-КСФ тують їх цитологічні препарати. ("Leucomax" "Novartis" / "Schering-Plaugh"). МоноДля виготовлення одного мазка до 0,2мл цити культивують при 37°С та 5% СО2 терміном 6 суспензії дендритних клітин поступово додають діб і отримують дендритні клітини. Ці клітини краплями 0,5мл 96° етилового спирту. Для 5 76372 6 відмивають розчином Рінгера шляхом центрифукою кількістю коротких тонких радіальних інтенсигування терміном 5 хвилин при 1000об/хв. внобазофільних відростків і окремими довгими Суспензію дендритних клітин розводять розчином відростками, до розвинутої слабобазофільної цитоплазми з чисельними довгими тонкими радіальРінгера до концентрації 1-2 106/мл і готують їх ними відростками та поодинокі округлі гіперхромні цитологічні препарати. ядра з рівномірною компактною структурою хроДля виготовлення одного мазка до 0,2мл матину, ядерця не виявляються. Ядерносуспензії дендритних клітин поступово додають цитоплазматичне співвідношення складає прибликраплями 0,5мл 96° етилового спирту. Для зно від 1:1,5 до 1:6. запобігання злипання клітин суспензія постійно Пояснення до графічних матеріалів винаходу: піпетується за допомогою піпетки об'ємом на 1,0 Фіг.1. Дендритні клітини, одержані з селезінки мл. Потім наносять шар дендритних клітин із тварин. Цитологічний препарат. Фарбування за суспензії з фіксуючим розчином на підготовлене за методом Паппенгейма, х1000. допомогою полі-L-лізину або бичого сироваткового Фіг.2. Дендритні клітини, одержані з перифеальбуміну предметне скло з наступним висушуричної крові хворих на рак яєчників. Цитологічний ванням клітинного матеріалу на повітрі. препарат. Фарбування за методом Паппенгейма, Зафіксовані дендритні клітини фарбують за метох1000. дом Паппенгейма: спочатку мазок фарбують фарДжерела інформації: бою-фіксатором Май-Грюнвальда 3 хвилини, потім 1. Гантиевская Ю.А., Селявко В. В. Дендритдодають таку ж кількість дистильованої води, ченые клетки: роль в системе иммунитета // Иммурез 1 хвилину фарбу зливають і наливають робонопатология, аллергология, инфектология. - 2001. чий розчин готової фарби Романовського-Гімзи - №4. -С.5-23. (при рН 6,8) на 2 хвилини. За підготовленими та2. Макаренкова В.П., Кост Н.В., Щурин М.Р. ким чином цитологічними препаратами дендритСистема дендритных клеток: роль в индукции имних клітин проводять мікроскопічне дослідження мунитета и в патогенезе инфекционных, аутоимпри збільшенні х400 та в імерсійній системі при ммунных и онкологических заболеваний // Иммузбільшенні x1000. нология. - 2002. -№2. - С.68-76. В цитограмах дендритних клітин, одержаних з 3. Петрова A.C., Полонская Н.Ю., Богатырев периферичної крові хворих на рак яєчників і мелаΒ.Η. Использование морфологических методов ному, виявляються дрібні округлі клітини різного исследования в клинической цитологии // Клиниступеня зрілості, розташовані порізно, в групах, ческая лабораторная аналитика / Под ред. скупченнях і пластах (Фіг.2). Вони мають різну циВ.В.Меньшикова. - Т. П. -М.: "Лабинформ"-РАМЛД, топлазму, в залежності від ступеня зрілості денд1999. - С. 108 (прототип). ритних клітин, - від вузького її обручика з невели 7 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 76372 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601