Спосіб визначення дельта-амінолевулінової кислоти в сироватці крові курей-несучок

Реферат: UA 76883 U UA 76883 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до аналітичної хімії, а саме до визначення дельтаамінолевулінової кислоти в сироватці крові тварин. Дельта-амінолевулінова кислота (6-АЛК), один із проміжних продуктів синтезу гему, попередник порфобіліногену, є біологічним маркером при отруєннях тварин сполуками важких металів, в тому числі плюмбумом. Існує спосіб визначення дельта-амінолевулінової кислоти в сечі [Май-zerall, D. The occurrence and determination of -aminolevulinic acid and porpho-bilinogen in urine [Text] / D. Mauzerall, Granick, S // J. Biol. Chem.-1956. - № 219. - P. 435-46.] Спосіб ґрунтується на розподілі порфобіліногену та дельта-амінолевулінової кислоти за допомогою адсорбції на колонках з іонообмінною смолою та колориметричному визначенні забарвленого в червоний колір АЛКпіролу. Але даний спосіб займає багато часу, недостатньо чутливий та специфічний. Існує спосіб, який передбачає конденсацію -АЛК сечі з етилацетоацетатом та утворення АЛК-піролу, який реагує з n-диметилбензальдегідом, внаслідок чого утворюється забарвлений продукт, який визначають спектрофотометрично за довжини хвилі 555 нм [Tomokuni, K. Simple method for determination of urinary delta-aminolevulinic acid as an index of lead exposure [Text] / K. Tomokuni, M. Ogata // Clin. Chem.-1972. - Vol. 18. - P. 1534-6]. Недоліком цих способів є те, що їх не можна застосувати для визначення концентрації 5АЛК в сироватці крові, оскільки її концентрація знаходиться на рівні, який ускладнює застосування аналітичних методів, що базуються на застосуванні спектрофотометричного детектування. Тому для покращення виявлення та хроматографічного розділення необхідно проводити дериватизацію амінокислоти, внаслідок чого буде утворена нова сполука з більш високим молярним коефіцієнтом поглинання в УФ-діапазоні. Дельта-амінолевулінова кислота належить до сполук амінокислотної природи, в зв'язку з чим, для її ідентифікації доцільно використовувати реактиви на вільну аміногрупу. Найбільш близьким до запропонованого способу є спосіб визначення дельтаамінолевулінової кислоти в сечі методом високоефективної хроматографії [Ogata, M. Quantitative determination of urinary delta-aminolevulinic acid as an index of lead exposure by highperformance liquid chromatography [Text] / M. Ogata, T. Taguchi // Industrial Health.-1986, Vol. 24. P. 259-264]. Спосіб передбачає взаємодію 8-АЛК з метилацетоацетатом та утворення АЛКпіролу, яке визначають методом високоефективної рідинної хроматографії. Умови хроматографування: колонка стальна "Reprosil Pur Aqua" С18 150 × 4,0 мм, 5,0 мкм; швидкість рухомої фази 1,2 мл/хв; температура термостату колонки 25 °C; довжина хвилі детектування 260 нм, елюент: фосфатний буфер-ацетонітрил Недоліком цього способу є недостатня чутливість та селективність. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення дельтаамінолевулінової кислоти в сироватці крові курей-несучок, що включає дериватизацію, елюювання, ідентифікацію, згідно з корисною моделлю, здійснюють передколонкову дериватизацію 1-фтор-2,4-динітробензолом, градієнтне елюювання та ідентифікацію методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії зі спектрофотометричним детектуванням, щоб забезпечити ефективність способу. Спосіб виконується таким чином. Для приготування розчину порівняння точну наважку 10 мг 8-АЛК вносять до мірної колби ємністю 100 мл, додають 80 мл 1 % розчину натрію тетраборату, перемішують до повного розчинення, доводять об'єм цим же розчинником до мітки та перемішують. До мірної колби ємністю 10 мл вносять 100 мкл розчину, додають 1,0 мл 3 % розчину 1-фтор-2,4-динітробензолу та 1,0 мл 1 % розчину натрію тетраборату, пробірку закривають, витримують у термостаті за температури 50 °C протягом 30 хв, потім додають 3 мл суміші діоксан-вода (1:1), кількісно переносять вміст пробірки до мірної колби ємністю 10 мл, доводять сумішшю розчинників до мітки та перемішують. Отриманий розчин фільтрують через фторопластовий фільтр з розміром пор не більше 0,5 мкм. Хроматографічний аналіз ДНФ-похідного АЛК, отриманого після дериватизації, проводять з використанням колонки стальної "Reprosil Pur Aqua" С18 150 × 2,0 мм, 3,0 мкм для оберненофазової високоефективної рідинної хроматографії. Градієнтне елюювання здійснюють шляхом змішування двох елюентів: рухома фаза "А" - 50 мл ацетонітрилу вносять до мірної колби ємністю 1000 мл, доводять об'єм фосфатним буферним розчином (рН 3,0) до мітки; рухома фаза "В" - 800 мл ацетонітрилу вносять до мірної колби ємністю 1000 мл та доводять об'єм фосфатним буферним розчином (рН 3,0) до мітки. Швидкість рухомої фази 0,4 мл/хв. Температура термостату колонки 35 °C. Детектування проводять з використанням спектрофотометричного детектору за довжини хвилі 360 нм. Ідентифікацію проводять за часом утримання піків. Кількісний вміст дельта-амінолевулінової кислоти ( X i , мг/мл) розраховують за формулою: 1 UA 76883 U Xi  Si  moi  0,1 0,1 10  1000  P Si  moi  P  Soi  V  100  100  10  100 Soi  V  100000 S i - середнє значення площ піків ДНФ - похідного дельта-амінолевулінової кислоти, розраховане з хроматограм досліджуваного розчину; So i - середнє значення площ піків ДНФ - похідного дельта-амінолевулінової кислоти, 5 розраховане з хроматограм розчину стандартного зразка дельта-амінолевулінової кислоти; moi - маса наважки стандартного зразка дельта-амінолевулінової кислоти, г; V - об'єм досліджуваного зразка, мл; Pi - вміст основної речовини у стандартному зразку дельта-амінолевулінової кислоти, %. 10 15 20 25 Приклад. Для кількісного визначення дельта-амінолевулінової кислоти 1,0 мл сироватки крові курейнесучок вносили до пробірки ємністю 10 мл, додаючи 1,0 мл 3 % розчину 1-фтор-2,4динітробензолу, 1,0 мл 1 % розчину натрію тетраборату, пробірку закривали, перемішували та витримували в термостаті за температури 50 °C протягом 30 хв. Потім додавали 3,0 мл суміші діоксан-вода (1:1). Вміст пробірки кількісно переносили до мірної колби ємністю 10,0 мл і доводили об'єм розчину до мітки сумішшю діоксан-вода (1:1) та перемішували. Отриманий розчин фільтрували через фторопластовий фільтр з розміром пор не більше 0,5 мкм. Хроматографування проводили на рідинному хроматографі з УФ-детектором в наступних умовах: колонка стальна "Reprosil Pur Aqua" C18 150 × 2,0 мм, 3,0 мкм; швидкість рухомої фази 0,4 мл/хв; температура термостату колонки 35 °C; довжина хвилі детектування 360 нм; елюент: буферний розчин-ацетонітрил. Детектування проводили з використанням спектрофотометричного детектору за довжини хвилі 360 нм. Ідентифікацію проводили за часом утримання піків. Для реагенту 1-фтор-2,4-динітробензолу, за даних умов хроматографування, характерна наявність піку з часом утримання 35,5 хв. Час утримання піку ДНФ-похідного амінокислоти становить 42,5 хв. Таким чином спосіб визначення дельта-амінолевулінової кислоти методом оберненофазової високоефективної рідинної хроматографії, що пропонується, є точним та селективним і може використовуватися як біологічний маркер для ранньої діагностики отруєнь курей - несучок сполуками плюмбуму в лабораторіях ветеринарної медицини. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб визначення дельта-амінолевулінової кислоти в сироватці крові курей-несучок, що включає дериватизацію, елюювання, ідентифікацію, який відрізняється тим, що здійснюють передколонкову дериватизацію 1-фтор-2,4-динітробензолом, градієнтне елюювання та ідентифікацію методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії зі спектрофотометричним детектуванням. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2