Спосіб одержання біологічно активних ліпофільної і гідрофільної фракцій плаценти свинячої

Спосіб одержання біологічно активних ліпофільної і гідрофільної фракцій плаценти свинячої, що включає попереднє відмивання плацентарних тканин водою, подрібнення, екстракцію із застосуванням органічних розчинників, який відрізняється тим, що відмиту плаценту піддають заморожуванню парами рідкого азоту до температури 80°С...-120°С, подрібнення проводять у кріогенних млинах при температурі -80°С...-120°С до розмірів частинок 20-30мкм, потім проводять ліофільне сушіння при тиску не вище 0,1мм рт ст. і температурі -10°С...-20°С, після чого постадійно екстрагують ліпофільну і гідрофільну фракції за допомогою хладонових розчинників і ізотонічного розчину хлориду натрію. Винахід відноситься до області ветеринарії, медицини, косметології. Прототипом винаходу є спосіб переробки плаценти, що включає подрібнення, екстракцію за допомогою органічних реагентів і розділення екстракту на фракції із застосуванням розчину хлориду натрію, який відрізняється тим, що екстракцію проводять 10-18 кратним об'ємом хлороформу і етанолу у співвідношенні 1:2, а розділення екстракту на фракції проводять шляхом введення 0,1-0,2 кратного об'єму розчину хлориду натрію, після чого з хлороформної фракції упарюванням одержують ліпідний комплекс, а з водно-етанольної фракції після упарювання і сушки одержують концентрат амінокислот і пептидів [UA, 15241, 15.09.2000]. До недоліків даного способу слід віднести: - неможливість повного розділення ліпофільної і гідрофільної фракцій; - екстракція органічними розчинниками приводить до хімічної взаємодії з біологічно активними компонентами плаценти, призводячи до деструктивних змін і знижуючи біологічну активність; - неможливість повного вилучення органічних розчинників призводить до побічних токсичних впливів на організм. Технічний результат винаходу - розділення фракцій плаценти свинячої зі збереженням їх нативної структури і зменшенням сторонніх домішок. Технічного результату досягають шляхом використання сучасної технології переробки тканин плаценти свинячої за такою методикою: 1. Кріоконсервування тканин плаценти свинячої Плаценту свинячу промивають проточною водою, фрагментують і піддають швидкому заморожуванню у парах рідкого азоту до температури від -80°С до -120°С із швидкістю 30 за хвилину. 2. Кріоподрібнення і кріосублімування тканин плаценти свинячої Кріоподрібнення плаценти свинячої здійснюють на кріомлині при охолодженні парами рідкого азоту до температур від -80°С до -120°С. Ступінь (19) UA (11) 77486 (13) (21) 20040806562 (22) 05.08.2004 (24) 15.12.2006 (31) 2003124738 (32) 07.08.2003 (33) RU (46) 15.12.2006, Бюл. №12, 2006р. (72) Шабунін Сєргєй Вікторовіч, RU, Востроілова Галіна Анатольєвна, RU, Мєщєряков Ніколай Прокофьєвіч, RU, Курило Миколай Федоровіч, Конев Володимир Федорович, Гребенщиков Віктор Юхимович, Бондар Лариса Олександрівна, Філатов Володимир Антонович, Осецький Олександр Іванович, Федченко Юрій Григорович, Осецька Марія Олександрівна, Лисенко Тетяна Михайлівна (73) ЗАКРИТОЄ АКЦІОНЄРНОЄ ОБЩЄСТВО НАУЧНО-ПРОІЗВОДСТВЄННОЄ ПРЄДПРІЯТІЄ "АГРОФАРМ", RU (56) UA A 63459 15.01.2004 C2 1 3 подрібнення тканин складає 20-30мкм. Одержаний порошок з тканин плаценти свинячої піддають ліофілізації при температурах у діапазоні від -10°С до -20°С і залишковому тиску у камері не вище 13,33Па протягом 16-20год. В результаті одержують порошок з вологістю 3-5%. 3. Здобування ліпофільної фракції з модифікованого порошку плаценти свинячої Екстрагування ліофілізованого порошку плаценти свинячої здійснюють на установці низькотемпературної екстракції за допомогою хладону, який є абсолютно інертним до здобуваної фракції. Рідкий хладон подається з напірних ємкостей під тиском (6,078-8,104)х105Па і температурі 30-35 С до екстрактора № 1, де знаходиться заздалегідь висушений порошок. Розчинник проходить через шар сублімованого порошку плаценти свинячої і здобуває з нього жиророзчинні речовини, потім через фільтр тонкої очистки зливається до випарника. У випарнику за рахунок зменшення тиску до атмосферного, враховуючи низьку температуру кипіння хладонів від -20°С до -40°С та їх леткість, стає можливим повністю вилучити розчинник (він направляється на регенерацію і повторне використання). В результаті цієї стадії стає можливим одержання чистого ліпофільного комплексу при збереженні стабільності здобуваних речовин та їх нативного комплексу. Вихід ліпофільної фракції складає 2-3% від завантаженого ліофілізованого порошку. Ліпофільна фракція являє собою коричнево-буру масу, що розм'якшується при кімнатній 77486 4 температурі. Зберігають її у морозильній камері при температурі -18°С. 4. Здобування гідрофільної фракції. Виділення гідрофільного коплексу плаценти свинячої здійснюють екстрагуванням залишку порошку після ліпофільної екстракції в ізотонічному розчині натрію хлориду при температурі 25-30°С протягом 3-4год. при постійному перемішуванні. Екстрагування повторюють два рази. Одержаний екстракт фільтрують і одержують гідрофільну фракцію плаценти свинячої. Розчин зберігають у морозильній камері при температурі -18°С. Звертає на себе увагу ефективність і швидкість процесу одержання гідрофільної фракції методом водно-сольової екстракції. На відміну від аналогів, де застосовують способи екстрагування водно-сольовим розчином, виділення гідрофільного комплексу здійснюється після одержання однорідного диспергування, ліофілізації і повного вилучення жиророзчинних речовин, а також ведеться при низьких температурах, які дозволяють зберегти усі діючі речовини. Одержана фракція плаценти свинячої містить у своєму складі ряд природних амінокислот і мікроелементів, які адаптовані до організму тварин, що вигідно відрізняє її від препарату-аналога. Сутність способа пояснюється прикладами. Приклад 1. Визначення оптимального режиму екстракції ліпофільної фракції З метою визначення оптимального режиму екстракції ліпофільної фракції здійснювались досліди по зміні параметрів. Результати наведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Порівняльна характеристика режимів низькотемпературної екстракції ліпофільної фракції з кріосублімованої сировини плаценти свинячої Одноразове заваРобочий тиск хлантаження субліТермін проведення Температура екст- Вихід ліпофільної №досліду дону в системі ексмованої сировини, екстракції, год. ракції, °С фракції, кг 5 тракції, х10 Па кг 1 10 6,078-8,104 2,0 30-35 2,1 2 10 6,078-8,104 2,5 30-35 2,4 3 10 6,078-8,104 3,0 30-35 2,5 4 10 6,078-8,104 4,0 30-35 2,7 5 10 6,078-8,104 5,0 30-35 2,7 Дані, які наведені у Таблиці 1, свідчать, що оптимальним терміном екстракції ліпофільної фракції плаценти свинячої є 4год. (дослід №4). Подальше збільшення терміну проведення екстрагування не призводить до підвищення проценту виходу по відношенню до завантаженої сублімованої сировини. Приклад 2. Визначення оптимального режиму водно-сольової екстракції гідрофільного комплексу з тканин плаценти свинячої після та до здобування ліпофільного комплексу Порошок, що залишився після виділення ліпофільної фракції, переноситься до екстрактора №2. Після цього додають 30л 0,85% ізотонічного розчину натрію хлориду, який приготували на воді дистильованій, перемішують протягом 3-4год. при температурі 25-30 С (Таблиця 2, досліди 1-10). Паралельно проводять дослід по здобуванню гідрофільної фракції з тканин плаценти свинячої, яку після кріоподрібнення не піддавали ліпофільній екстракції (Таблиця 2, дослід 11). У якості критерію проведення повноти екстрагування гідрофільних речовин, що містяться у плаценті, береться вміст іонів Fe3+. Усі досліди проводились в одному температурному режимі 25-30 С. 5 77486 6 Таблиця 2 Визначення оптимального режиму водно-сольової екстракції гідрофільного комплексу з тканин плаценти свинячої після (досліди № 1-10) та до (дослід № 11) здобування ліпофільного комплексу Кількість + № ізотонічного розчи- Температура екст- Термін проведення Вміст Fe3 в екстпорошку, що екстдосліду ракції, °С екстракції, год. ракті, мкм/л ну натрію хлориду, рагують, кг л 1 0,87 30 25-30 1 170,7 2 0,87 30 25-30 2 200,06 3 0,87 30 25-30 3 235,1 4 0,87 30 25-30 4 238,15 5 0,87 40 25-30 4 237,4 6 0,87 50 25-30 4 237,0 7 0,87 60 25-30 4 236,0 8 0,87 30 25-30 5 230,6 9 0,87 30 25-30 6 230,8 10 0,87 30 25-30 7 215,3 11 0,87 30 25-30 4 40,31 На основі даних, що наведені у Таблиці 2, вибрано оптимальний режим водно-сольового екстрагування з метою одержання гідрофільної фракції. Показано (дослід №11), що проведення екстрагування гідрофільної фракцій без початкового здобування жиророзчинних компонентів у 5,9 рази знижує ефективність водно-сольової екстракції. Приклад 3. Визначення складу ліпофільної фракції З метою визначення складу ліпофільної фракції було проведено біохімічний аналіз фракції, який показав: вміст загальних ліпідів, г/л 462,0; вміст тригліцеридів, ммоль/л 31,0; холестерин, ммоль/л 11,5; цинк, мкМ/л 24,95; мідь, мкМ/л 19,20; марганець, мкМ/л 0,36. Приклад 4. Визначення складу амінокислот і мікроелементів у гідрофільній фракції З метою визначення складу амінокислот і мікроелементів у гідрофільній фракції було проведено аналіз, результати якого наведені у Таблиці 3. Таблиця 3 Вміст амінокислот, макро- і мікроелементів у гідрофільній фракції Амінокислоти Макро- і мікроелементи Показники Цистеїнова кислота Аспарагінова кислота Треонін Серін Глутамінова кислота Гліцин Аланін Валін Метіонін Ізолейцин Лейцин Тірозин Фенілаланін Гистидін Лізин Гама-аміномасляна кислота Цитрулін Мідь Цинк Марганець Залізо Кальцій Фосфор неорганічний Вміст,мкМ/л 81,4 107,6 270,4 241,7 213,8 396,0 593,1 395,0 136,7 200,0 582,6 75,6 108,6 139,5 438,7 71,4 50,4 2,05 99,3 4,9 238 2,1 8,4 7 77486 Дані, що наведені у Таблиці 3, дозволяють зробити такі висновки. Наявність у складі фракцій плаценти свинячої поліпептидів, амінокислот, мікро- і макроелементів, оксикислот та інших біологічно активних речовин викликає нормалізацію метаболічних процесів в організмі, проявляє імуномодулюючий і адаптогенний вплив. Приклад 5. Випробування ліпофільної та гідрофільної фракцій при лікуванні тварин При випробуваннях фракцій, що одержані по заявляемому способу, у виробничих умовах був 8 виявлений широкий спектр їх дії і висока ефективність для профілактики і лікування різних захворювань у корів, свиней і молодняку сільськогосподарських тварин. В результаті проведених випробувань у господарствах Воронезької області і окремих господарств Харківської області був одержаний високий ефект лікувальної і профілактичної дії, що перевищує по ефективності прототип. Дані наведені у Таблиці 4, 5. Таблиця 4 Результати випробування ліпофільної та гідрофільної фракцій при лікуванні сільськогосподарських тварин Показники Кількість тварин, голів Видужало, голів (%) Тривалість лікування, діб Залишилось хворих, голів (%) Ліпофільна фракція Гідрофільна фракція 47 50 42 (89,4) 46 (92,0) 10,8±0,35 10,7±0,14 5 (10,6) 4 (8,0) Прототип 44 38 (86,4) 13,2±1,54 6 (13,6) Таблиця 5 Результати випробування ліпофільної та гідрофільної фракцій при лікуванні тварин, які захворіли післяпологовими ендометритами Показники Кількість тварин, голів Захворіло післяпологовими ендометритами, голів (%) Групи тварин Застосовувалась Застосовувалась Застосовувався ліпофільна фрак- гідрофільна фракпрототип ція ція 31 32 25 4 (12,9) Заявляємий спосіб дозволяє реалізувати послідовне якісне розділення ліпофільної і гідрофільної фракцій плаценти свинячої з максимальним виходом біологічно активних речовин. Це поси Комп’ютерна верстка В. Сердюк 5 (15,6) Без застосування препарату 5 (20,0) 24 18 (75,0) лює їх специфічну біологічну активність. Одержані фракції є цінною основою для створення лікарських форм. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601