Спосіб отримання ліпосомальної форми аденозин-5′-трифосфату (атф) для перорального застосування

Реферат: Спосіб отримання ліпосомальної форми аденозин-5'-трифосфату (АТФ) для перорального застосування, шляхом розчинення суміші лецитину, холестерину і поліетиленгліколю в органічному розчиннику, з наступним випарюванням до утворення ліпідної плівки, додаванням розчину АТФ, заморожуванням при -80 °C i таненням при температурі +30 °C, а також відділенням невключених в ліпосоми речовин за допомогою центрифугування. В суміші використовують соняшниковий лецитин, холестерин та поліетиленгліколь у молярному співвідношенні 70:50:0,5 відповідно, здійснюють 10-кратне повторювання циклу заморожуваннятанення, для забезпечення утворення більш жорстких ліпосом, і ліофільно висушують отримані ліпосоми з АТФ. UA 77865 U (12) UA 77865 U UA 77865 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до харчової промисловості і може бути використана для одержання ліпосом, що містять фізіологічно активну речовину - аденозин-5'-трифосфат (АТФ) з метою перорального застосування. Ліпосоми можуть надалі бути використані для виробництва продуктів спеціального дієтичного споживання (використання). Аденозин-5'-трифосфат (АТФ) - нуклеотид, який відіграє роль універсального джерела енергії для всіх біохімічних процесів, що протікають в організмі людини. Однак, при екзогенному надходженні, молекули АТФ не доставляються до клітин, так як руйнується ферментом ектоАТФ-дифосфорилазою до аденозиндифосфату (АДФ), аденозинмонофосфату (АМФ) і аденозину. Практично весь аденозин поглинається еритроцитами, в яких перетворюється в інозин (рибоксин) за участі ферменту аденозин-диамінази. Доцільність поміщення АТФ в ліпосоми для захисту від руйнування, доведена низкою досліджень, що підтверджують його ефективність [3, 4]. Відомий спосіб одержання ліпосом, що описаний в [статті: Arakawa А. Preporation of liposome-encapsulationg adenosine triphosphate/ A. Arakawa, S. Ishiguro, K. Ohki, M. Tamai// Tohoku J. Exp.Med.-1998. - P. 39-47] передбачає одержання ліпосом в три стадії. На першій стадії суміш яєчного фосфатидилхоліну і холестерину розчиняють в органічному розчиннику. Утворений розчин випарюють під вакуумом до утворення ліпідної плівки на стінках колби і додають розчин АТФ з розрахунку 100-500 ммоль АТФ на 10-50 ммоль ліпіду. Друга стадія полягає в 5-хвилинній обробці цього розчину ультразвуком при температурі 50 °C. На третій стадії здійснюють відділення ліпосом від невключеного розчину АТФ шляхом гель-фільтрації. Цей метод має низку недоліків: низький відсоток включення АТФ, нестабільність одержаних ліпосом. Окрім того, ліпосоми, отримані цим методом, потрапляючи в кровообіг, швидко руйнуються макрофагами. Прототипом корисної моделі можна вважати спосіб, що описаний в статті [стаття: Liang W. Encapsulation of ATP into liposomes by different methods: optimization of the procedure/ W. Liang, T.S. Levchenko, V.P. Torchilin// Journal of Microencapsulation.-2004. - P. 251-261]. Відповідно до проведених авторами статті досліджень, найбільш ефективним, з-поміж інших, щодо включення АТФ в ліпосоми, виявився метод замороження-танення. Саме він і був взятий за основу при розробці корисної моделі. Для отримання ліпосом відважують яєчний фосфатидилхолін, холестерин і поліетиленгліколь в молярному співвідношенні 70:30:0,5. Поліетиленгліколь використовують з метою подовження тривалості перебування ліпосом в крові. Підготовлену суміш розчиняють в органічному розчиннику, після чого випарюють до утворення ліпідної плівки. Готують розчин АТФ з концентрацію 400 ммоль/л і наливають його в колбу з ліпідною плівкою на стінках, заповнюють аргоном і закупорюють. Плівка поступово гідратує, при цьому колбу помішують протягом 30 хв при 40 °C. Потім здійснюють 5 циклів заморожування при температурі -80 °C і танення на водяній бані при температурі +30 °C. Авторами статті досліджено 3 способи відділення ліпосом від невключеного розчину АТФ: центрифугування, діаліз та фільтрація гелю. Ефективність усіх 3-х методів була приблизно однакова, з деякою перевагою центрифугування. Утворену емульсію ліпосом послідовно пропускають через мембрани екструдера з діаметром пор 800, 600, 400 і 200 нм для отримання ліпосом з незначним розподілом розмірів. Ліпосоми з АТФ, отримані цим способом, підходять для парентерального введення, проте руйнуються в кишечнику при споживанні перорально. Окрім того, концентрація розчину АТФ, яку вводять в ліпосоми, є досить високою, і повинна бути знижена для застосування в харчовому продукті. В основу корисної моделі поставлено задачу розробки способу отримання ліпосомальної форми АТФ. Поставлена задача вирішується тим, що враховуючи харчове призначення корисної моделі, для виготовлення ліпосом використано соняшниковий лецитин, який є гіпоалергенним. Для підвищення жорсткості ліпосом, лецитин і холестерин змішують в молярному співвідношенні 70:50 відповідно. Для збільшення тривалості перебування ліпосом у кровообігу, використовують поліетиленгліколь у кількості 0,5 моль. Отриману суміш розчиняють в органічному розчиннику i випарюють у вакуумному роторному випарнику до утворення ліпідної плівки. 20 ммоль/л розчин АТФ додають до ліпідної плівки і піддають гідратації протягом 30 хв при температурі 40 °C, періодично помішуючи. Для утворення жорсткіших ліпосом, було збільшено кількість циклів заморожування-танення з 5-ти (за методикою аналога) до 10-ти. Заморожування здійснюють при температурі -80 °C, танення - на водяній бані при температурі +30 °C. Відділення ліпосом від невключеного розчину АТФ здійснюють методом центрифугування. Для забезпечення тривалого зберігання, а також для зручності подальшого використання, ліпосоми заморожують та піддають ліофільному висушуванню. 1 UA 77865 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Результати досліджень свідчать про те, що ліпосоми, виготовлені цим способом, мають більш жорстку оболонку, тому не руйнуються у кишечнику, а отже можуть використовуватись для виробництва харчових продуктів. Приклад На лабораторних вагах з точністю до 0,001 г зважуємо 0,426 г лецитину, 0,176 г холестерину та 0,007 г поліетиленгліколю. Всі вищевказані компоненти поміщають в колбу роторного випарювана, додають 2-3 мл органічного розчинника і перемішують до повного розчинення. Розчин випарюють на вакуумному роторному випарювані до утворення ліпідної плівки на стінках колби. Готують 1 % розчин АТФ, шляхом розведення 0,03 г динатрію аденозин-5'трифосфату в 3 мл дистильованої води. Розчин АТФ додають в колбу з ліпідною плівкою, закупорюють та поміщають в змішувач на 30 хв при температурі 40 °C. Емульсію, що утворилась, заморожують в морозильній камері при температурі -80 °C. Танення проводять на водяній бані при температурі +30 °C до повного переходу емульсії в рідкий стан. Цикл замороження - танення повторюють ще 9 разів. Не включені в лiпосоми речовини відділяють шляхом центрифугування протягом 20 хв при 10 000 g і температурі +15 °C. Після цього їх ще раз заморожують і піддають ліофільному висушуванню. Джерела інформації: 1. Arakawa A. Preporation of liposome-encapsulationg adenosine triphosphate / A. Arakawa, S. Ishiguro, K. Ohki, M. Tamai// Tohoku J. Exp.Med.-1998. - P.39-47. 2. Liang W. Encapsulation of ATP into liposomes by different methods: optimization of the procedure/ W. Liang, T. S. Levchenko, V.P. Torchilin// Journal of Microencapsulation.-2004. - P.251261. 3. Verma D. Adenosine Triphosphate-Loaded Liposomes for Myocardium Preservation Under Ischemic Conditions/ D. Verma, T. S. Levchenko, V. P. Torchilin// Liposome Technology. Third Edition. - New York, 2007.-434 p. 4. Han YY. Liposomal ATP or NAD ρ protects human endothelial cells from energy failure in a cell culture model of sepsis/ Han YY, Huang L, Jackson EK// Res Commun Моl Pathol Pharmacol.-2001. P. 15-25. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання ліпосомальної форми аденозин-5'-трифосфату (АТФ) для перорального застосування, шляхом розчинення суміші лецитину, холестерину і поліетиленгліколю в органічному розчиннику, з наступним випарюванням до утворення ліпідної плівки, додаванням розчину АТФ, заморожуванням при -80 °C i таненням при температурі +30 °C, а також відділенням невключених в ліпосоми речовин за допомогою центрифугування, який відрізняється тим, що в суміші використовують соняшниковий лецитин, холестерин та поліетиленгліколь у молярному співвідношенні 70:50:0,5 відповідно, здійснюють 10-кратне повторювання циклу заморожування-танення, для забезпечення утворення більш жорстких ліпосом, і ліофільно висушують отримані ліпосоми з АТФ. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2