Спосіб одержання ліпосомальної форми протипухлинного антибіотика

Спосіб одержання ліпосомальної форми протипухлинного антибіотика шляхом висушування фосфатидилхоліну у вакуумі, його емульгування у водному середовищі, що містить антибіотик, диспергування емульсії, стерилізуючої фільтрації та розливу, який відрізняється тим, що співвідношення антибіотик: фосфатидилхолін у водному середовищі емульгування становить 1:(53-60) мас. ч., диспергування емульсії виконують з додаванням лактози у кількості 2,3-3,0 мас. % і після стерилізуючої фільтрації та розливу здійснюють ліофільне висушування. Винахід належить до фармації, а саме до способу одержання ліпосомального препарату, який може використовуватися як протипухлинний засіб. Відомий спосіб одержання ліпосомального препарату шляхом висушування суміші ліпідів: фосфатидилхоліну, кардіоліпіну (діфосфатидилгліцерину) та холестерину у вакуумі, емульгування їх у водному середовищі, що містить антибіотик, одержання ліпосом, дезінтегрування ультразвуком, відділенням надалі незв'язаного антибіотика діалізом, стерилізуючої фільтрації та розливу [Європейський патент №0198765, МПК А61К 9/50, 1986]. Цей спосіб має ряд недоліків: окислення фосфоліпідів у процесі ультразвукового впливу, тривалість процесу у зв'язку з низькою продуктивністю обладнання та діалізу, нестабільність фізико-хімічних властивостей у процесі одержання та зберігання, нестандартність складу. Відомий також спосіб одержання ліпосомального препарату [Патент України №6700, МПК5 А61К31/685, 1994], обраний прототипом заявляємого об'єкта, як найбільш близький його аналог за сукупністю ознак, а саме: суттю і послідовністю здійснення основних операцій і заходів, хімічною природою компонентів – фосфоліпідів, ліпосомальною організацією цільового продукту і близькістю його фармакотерапевтичних проявів. Спосіб за прототипом передбачає: висушування фосфатидилхоліну та дифосфатидилгліцерину у вакуумі, емульгування їх у водному середовищі, що містить антибіотик (доксорубіцин або інший антибіотик антрациклінового ряду: фарморубіцин, адріабластин та ін.), з співвідношенням антибіотик: фосфоліпіди 1:(17-20) мас.ч. та глюкозу у кількості 18-22 мас. %, гомогенізацію (диспергування) ліпідної емульсії, стерилізуючу фільтрацію та розлив. Цей спосіб має ряд суттєвих недоліків: присутність у препараті глюкози не дозволяє застосовувати препарат для лікування хворих на цукровий діабет; нестабільність фізико-хімічних властивостей у процесі зберігання, що обумовлено присутністю у препараті кислого фосфоліпіду – дифосфатидилгліцерину, утворюючого негативно заряджені домени у ліпідному біслої ліпосоми; виділення токсичних продуктів у процесі зберігання у зв'язку з вивільненням з ліпосоми антибіотика. В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу створити такий спосіб одержання (19) UA (11) 64591 (13) C2 (21) 2003076190 (22) 03.07.2003 (24) 16.01.2006 (46) 16.01.2006, Бюл. № 1, 2006 р. (72) Дудниченко Олександр Сергійович, Теміров Юрій Павлович, Швец Віталій Іванович, RU, Краснопольський Юрій Михайлович, Сеннікова Ірина Георгіївна (73) Дудниченко Олександр Сергійович, Теміров Юрій Павлович, Швец Віталій Іванович, RU, Краснопольський Юрій Михайлович, Сеннікова Ірина Георгіївна (56) UA C2 6700 29.12.1994 EP A2 0198765 22.10.1986 UA A 14629 29.12.1994 EP A1 0278465 17.08.1988 3 64591 4 ліпосомальної форми протипухлинного стерилізуючу фільтрацію та розлив, згідно з винаантибіотика, у якому технологічні стадії та параходом, співвідношення антибіотик: метри процесу дозволяють отримати препарат з фосфатидилхолін у водному середовищі емульгунизькою токсичністю, стабільними фізиковання становить 1: (53-60) мас. ч., диспергування хімічними властивостями у процесі зберігання, що емульсії виконують з додаванням лактози у збільшує термін зберігання, зробити можливим кількості 2,30-3,00 мас. % і після стерилізуючої вживання препарату для лікування хворих на цукфільтрації та розливу здійснюють ліофільне висуровий діабет. шування. Поставлена задача вирішується тим, що у Залежність фізико-хімічних властивостей превідомому способі одержання ліпосомальної форми парату від співвідношення антибіотик: протипухлинного антибіотика, що включає висуфосфатидилхолін і від кількості лактози в ліпідній шування фосфатидилхоліну у вакуумі, його емульемульсії та технічний результат, що отриманий за гування у водному середовищі, що містить їх допомогою, наведені в табл. 1, 2. антибіотик, диспергування ліпідної емульсії, Таблиця 1 Залежність фізико-хімічних властивостей препарату від співвідношення антибіотик: фосфатидилхолін Показники Включення антибіотика до ліпосоми, % Токсичність препарату LD50, мг/кг Оптична щільність при виготовленні при 540нм 1:45 Співвідношення антибіотик: фосфатидилхолін, мас. ч. 1:50 1:53 1:57 1:60 1:65 1:70 83,6 88 94,3 95,6 95 95,4 94,8 34,3 36,8 44,5 43,8 46,4 45,8 46,0 0,11 0,13 0,16 0,168 0,181 0,230 0,264 Як видно з даних, наведених у табл. 1, оптимальним є співвідношення антибіотик: фосфатидилхолін 1:(53-60) мас. ч. Використання співвідношень, менш зазначених призводить до неповноти включення антибіотика до ліпосоми, що значно збільшує токсичність препарату, через те, що вільна форма антибіотику має високу токсичність, а саме кардіотоксичність. Збільшення співвідношення призводить до неможливості одержання стандартної емульсії препарату та значно перешкоджає процесу стерилізуючої фільтрації у зв'язку зі збільшенням оптичної щільності. Таблиця 2 Залежність фізико-хімічних властивостей препарату від кількості лактози в ліпідній емульсії Показники Оптична щільність при ресуспендуванні Включення антибіотика до ліпосоми, % Розмір ліпосом після ресуспендування, нм Вміст лактози, % 2,6 3,0 1,8 2,1 2,3 0,46 0,42 0,35 0,37 86,0 91,8 94,6 94,0 3,3 3,5 0,35 0,35 0,32 95,6 90,0 87,0 від 270 до від 230 до від 170 до від 170 до від 170 до від 130 до від 120 до 350 300 290 290 250 270 300 Як видно з даних, наведених у табл. 2, оптимальним є кількість стабілізатора – лактози 2,3-3,0 мас. %. Використання концентрацій нижче зазначених призводить до збільшення оптичної щільності при ре суспендуванні ліофільне висушеного препарату в розчині натрію хлориду для ін'єкцій, що свідчить про збільшення розміру ліпосом та небажано при внутрішньовенному введенні препарату. Крім того, знижується включення антибіотика до ліпосоми. Збільшення концентрації лактози також призводить до зниження включення антибіотика до ліпосоми. Ліофільне висушування дозволяє отримати протипухлинний препарат у вигляді ліофілізованої маси для ін'єкцій (у відомому способі за прототипом препарат отримують у вигляді ліпідної емульсії), що також сприяє стабільності фізико-хімічних властивостей препарату у процесі зберігання та збільшенню терміну зберігання препарату, зниженню токсичності ліофілізованого препарату у порівнянні з рідким препаратом, у якому через нестабільність ліпосом з'являється високотоксичний вільний антибіотик (доксорубіцин або інший антибіотик антрациклінового ряду). Переваги способу, що заявляється, перед способом за прототипом наведені в табл. 3. 5 64591 6 Таблиця 3 Характеристики препарату в залежності від способу одержання Показники Термін зберігання препарату, місяців Токсичність препарату протягом терміну зберігання, LD50, мг/кг Включення антибіотика до ліпосоми, % Спосіб, що заявляється Не менш 12 Спосіб за прототипом 6 43,8-46,4 24-32 94,0-95,6 90-95,6 Таким чином, спосіб, що заявляється ,має суттєві переваги перед способом за прототипом: 1. Використання в якості стабілізатора лактози, замість глюкози, дозволяє вживати препарат для лікування хворих на цукровий діабет. 2. Дозволяє виключити зі складу препарату кислий фосфоліпід – дифосфатидилгліцерин, який утворює негативно заряджені домени у ліпідному подвійному шару ліпосом, що збільшує стабільність фізико-хімічних властивостей отриманого препарату у процесі зберігання та забезпечує збільшення терміну його зберігання. 3. Завдяки ліофільному висушуванню дозволяє випускати протипухлинний препарат у вигляді ліофілізованої маси для ін'єкцій (на відміну від способу – прототипу, де препарат отримують у вигляді ліпідної емульсії), що також сприяє стабільності фізико-хімічних властивостей препарату у процесі зберігання та збільшенню терміну зберігання препарату, зниженню токсичності ліофілізованого препарату у порівнянні з рідким препаратом, у якому через нестабільність ліпосом з'являється високотоксичний вільний антибіотик (доксорубіцин або інший антибіотик антрациклінового ряду). 4. При перевірці препаратів у відповідності до вимог тесту на токсичність було виявлено, що для загибелі 50% дослідних тварин їм необхідно ввести препарату, виготовленого за способом, що заявляється 43,8-46,4мг/кг, за прототипом – 2432мг/кг. Таким чином, це свідчить про значне (майже удвічі) зменшення токсичності препарату, отриманого за способом, що заявляється. При цьому включення антибіотика до ліпосоми практично однакове (див. табл. 3). Можливість здійснення винаходу ілюструється наступними прикладами: Приклад 1 Спиртовий розчин фосфатидилхоліну яєчного жовтка, що містить 795г фосфатидилхоліну, висушують на роторному випарнику у вакуумі при температурі 35-37°С до одержання тонкої ліпідної плівки. Одержану плівку фосфатидилхоліну емульгують у 30л водного розчину, що містить 15г доксорубіцину (або іншого антибіотика антрациклінового ряду: фармарубіцину, адріабластину та ін.) Суміш перемішують протягом 2-3 год. до отримання однорідної ліпідної емульсії. Емульсію диспергують у реакторі гомогенізатора високого тиску ”α-Laval” при тиску 5,4.107-5,8.107Па та температурі 35-40 С. Процес здійснюють з додаванням лактози у кількості 690г. Після досягнення оптичної щільності 0,16-0,18 (розведення 1:5) при 540нм процес припиняють. Отриману емульсію піддають стерилізуючій фільтрації на установці „Мillipore” через мембранні фільтри з розміром пор спочатку 0,65мкм, а потім – 0,22мкм та дозовано розливають в стерильних умовах у скляні флакони по 20мл. Флакони з емульсією піддають заморожуванню до (-40°С) та проводять ліофільне (сублімаційне) висушування. Флакони з ліпосомальним продуктом герметизують в атмосфері інертного газу. Форма випуску: ліофілізована маса для ін'єкцій. Термін зберігання препарату без зміни фізико-хімічних властивостей не менш 12 місяців. Токсичність препарату LD5044,5мг/кг. Включення антибіотика до ліпосоми 94,0%. Приклад 2 Спиртовий розчин фосфатидилхоліну яєчного жовтка, що містить 855г фосфатидилхоліну, висушують на роторному випарнику у вакуумі при температурі 35-37°С до одержання тонкої ліпідної плівки. Одержану плівку фосфатидилхоліну емульгують у 30л водного розчину, що містить 15г доксорубіцину (або іншого антибіотика антрациклінового ряду: фармарубіцину, адріабластину та ін.) Суміш перемішують протягом 2-3 год. до отримання однорідної ліпідної емульсії. Емульсію диспергують у реакторі гомогенізатора високого тиску ” α -Laval” при тиску 5,4.1075,8.107Па та температурі 35-40 С. Процес здійснюють з додаванням лактози у кількості 780г. Після досягнення оптичної щільності 0,16-0,18 (розведення 1:5) при 540нм процес припиняють. Отриману емульсію піддають стерилізуючій фільтрації на установці „Мilliроrе” через мембранні фільтри з розміром пор спочатку 0,65мкм, а потім – 0,22мкм та дозовано розливають в стерильних умовах у скляні флакони по 20мл. Флакони з емульсією піддають заморожуванню до (-40°С) та проводять ліофільне (сублімаційне) висушування. Флакони з ліпосомальним продуктом герметизують в атмосфері інертного газу. Форма випуску: ліофілізована маса для ін'єкцій. Термін зберігання препарату без зміни фізико-хімічних властивостей не менш 12 місяців. Токсичність препарату LD5043,8мг/кг. Включення антибіотика до ліпосоми 95,6%. Приклад 3 Спиртовий розчин фосфатидилхоліну яєчного жовтка, що містить 900г фосфатидилхоліну, висушують на роторному випарнику у вакуумі при температурі 35-37°С до одержання тонкої ліпідної плівки. Одержану плівку фосфатидилхоліну емульгують у 30л водного розчину, що містить 15г 7 64591 8 доксорубіцину (або іншого антибіотика ліофілізована маса для ін'єкцій. Термін зберігання антрациклінового ряду: фармарубіцину, препарату без зміни фізико-хімічних властивостей адріабластину та ін.) Суміш перемішують протягом не менш 12 місяців. Токсичність препарату 2-3 год. до отримання однорідної ліпідної емульсії. LD50=46,4мг/кг. Включення антибіотика до Емульсію диспергують у реакторі гомогенізатора ліпосоми 95,0%. . 7 високого тиску ” α -Laval” при тиску 5,4 10 З огляду на викладене вище і з урахуванням . 7 розкритого причинно-наслідкового зв'язку між 5,8 10 Па та температурі 35-40 С. Процес сукупністю ознак винаходу, що заявляється, та здійснюють з додаванням лактози у кількості 900г. технічним результатом, що отриманий за їх допоПісля досягнення оптичної щільності 0,16-0,18 могою, можна стверджувати, що завдання, покла(розведення 1:5) при 540нм процес припиняють. дене в основу створеного способу одержання Отриману емульсію піддають стерилізуючій ліпосомальної форми протипухлинного фільтрації на установці „Мillіроrе” через мембранні антибіотика, цілком виконане, бо такий спосіб фільтри з розміром пор спочатку 0,65мкм, а потім дозволяє отримати препарат з низькою – 0,22мкм та дозовано розливають в стерильних токсичністю, стабільними фізико-хімічними влаумовах у скляні флакони по 20мл. Флакони з стивостями у процесі зберігання, що збільшує емульсією піддають заморожуванню до (-40°С) та термін зберігання, зробити можливим вживання проводять ліофільне (сублімаційне) висушування. препарату для лікування хворих на цукровий Флакони з ліпосомальним продуктом герметизудіабет. ють в атмосфері інертного газу. Форма випуску: Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601